機械負荷激活MLO-Y4骨樣細胞系中的YAP/TAZ信號通路和趨化因子表達
機械負荷通過調節骨重塑在維持骨穩態中起重要作用。骨細胞是嵌入礦化骨基質中最豐富的細胞類型，是控制骨重塑以響應機械力的主要機械傳感器。骨細胞機械傳感特性導致不同類型的受體和不同的細胞內信號通路的激活。骨細胞也是核因子κB配體受體激活子（RANK-L）的主要來源，并且可以通過下調RANK-L與骨保護素的比例來負調節破骨細胞分化以響應機械負荷。
YES相關蛋白（YAP）和具有PDZ結合基序的轉錄共激活因子（TAZ）首先在果蠅中被發現，被認為是發育過程中器官生長的主要調節因子。YAP/TAZ受到機械和細胞骨架信號的調節，并作為機械轉換器控制細胞命運，以響應細胞微環境的特性。YAP/TAZ與不同的成骨細胞發生信號通路相互作用，如轉化生長因子β/骨形態發生蛋白通路和Wnt/β-catenin信號通路。新出現的證據表明，YAP/TAZ在成骨細胞生成過程中的機械敏感性中起作用。以往研究還在骨細胞系MLO-Y4中證明，Piezo 介導機械轉導并誘導YAP / TAZ核易位以響應剪切應力。
鑒于這些發現，已經提出了YAP/TAZ在骨細胞中的潛在作用的問題，特別是在響應3D機械負荷時。因此，在法國巴黎拉里布瓦西埃醫院、巴黎大學健康學院及英國曼徹斯特曼徹斯特大學生物科學學院聯合研究的一項實驗中利用了一種新的承受壓縮應力的3D培養模型來表征骨細胞樣細胞系MLO-Y4在機械負荷下的反應。相關內容發表在 Laboratory Investigation 期刊題為“Mechanical loading activates the YAP/TAZ pathway and chemokine expression in the MLO-Y4 osteocyte-like cell line”。
首先，為了確定骨細胞樣細胞系響應機械負荷的最佳條件，實驗對MLO-Y4細胞使用了循環機械2D拉伸和3D壓縮。將循環或靜態拉伸應用于2D細胞培養模型，拉伸百分比、頻率、信號形式和拉伸持續時間是可調的，MLO-Y4培養物以0.3 Hz的正弦波形和3%伸長率進行接受9小時的等雙軸動態拉伸。此外，在體外壓縮裝置將3D MLO-Y4培養物置于0-40 kPa的循環壓縮下，以1 Hz的正弦波形持續9小時。與2D拉伸和卸載機械條件相比，3D培養壓縮激活了某些機械敏感基因，例如E11和COX2編碼Ptgs2（圖1 A）。因此，后續實驗選擇了3D骨細胞壓縮模型。
骨細胞樣細胞系MLO-Y4機械負荷導致YAP/TAZ通路的激活，如靶基因Ankdr1和Tead4的表達增加所示（圖1 B），免疫熒光進一步證實了YAP/TAZ信號的激活，并量化了核易位，這在機械負荷下增加（圖1 C）。3D壓縮不僅降低了Yap表達，而且增加了Taz表達（圖1 D）。此外，3D壓縮增強了YAP/TAZ的蛋白表達，從而表明YAP/TAZ蛋白的穩定（圖1 E）。為了確認體內骨細胞YAP / TAZ的表達，在6月齡的小鼠股骨中進行抗體標記，在皮質骨和小梁骨中均發現YAP/TAZ染色。
圖1 YAP/TAZ活化和核易位的分析。
（A）通過實時 qPCR 評估的 E11/gp38 和 Ptsg2（編碼 COX-2）基因表達，以響應 2D（拉伸）或 3D 培養（壓縮）中的機械負荷。（B）機械加載后通過實時qPCR評估的 YAP/TAZ 靶基因表達。（C）免疫熒光測量的 YAP/TAZ 核易位YAP/TAZ（綠色）和細胞核（DAPI，藍色）的圖像。（D）通過實時qPCR 檢測機械負荷對YAP1和WWTR1 （TAZ）基因表達的影響。（E）MLO-Y4中YAP和TAZ的免疫印跡在3D培養中進行機械加載。
接下來，通過RNAseq確定由作為骨細胞機械傳感過程一部分的YAP/TAZ調節的生物過程。首先篩選Yap/Taz shRNA敲低的細胞，基于Yap和Taz shRNA的沉默足以降低YAP/TAZ mRNA和蛋白質水平。
RNAseq分析證明，無論YAP/TAZ敲低如何，負荷成分占方差的大部分，這表明負荷因子的影響很大（圖2 A）。圖2 B-D顯示了MA 圖，即對數平均值（A值）與log2倍變化（M值）的對比圖。在對照細胞中，Cxcl2是機械負荷誘導的上調幅度最大的基因（圖2 B）。與YAP/TAZ缺失相比，3D負荷誘導了更多的富集基因（圖2 B），從而避免了由這些轉錄共激活因子沉默引發的離散基因譜。在機械負荷下，YAP或TAZ缺失的基因反應反應有一定的相似性，表明存在一定程度的富集。Fbn2是機械負荷下骨細胞中YAP和TAZ個體缺失下上調的基因之一。此外，YAP和TAZ的沉默是有效的，因為這兩種轉錄輔助因子都是下調最多的基因之一（圖2 C、D）。
圖2 主成分分析和MA（比率強度）圖。
（A）機械負荷（主成分1 ，PC1）和 YAP/TAZ 沉默（主成分2 ，PC2）的主成分分析 （PCA）。（B-D）散點圖描述了兩個條件之間變化的分布（在y軸上：（B）shControl 卸載與 shControl 負載；（C）shControl 負載與shYAP 負載；（D）shControl 負載與 shTAZ 負載）。下調和上調基因分別以紅色和綠色表示。
此外，GO分析用于鑒定骨細胞樣細胞系MLO-Y4中機械負荷下由YAP/TAZ調節的生物過程。結果表明，TEAD1和TEAD2是通過YAP響應機械負荷而調節的主要基因之一，因為YAP的缺失突出了導致這些GO terms 的基因的改變。細胞加載后，與樹突形態發生相關的幾個GO terms 被突出顯示，從而提示YAP和TAZ在骨細胞功能與腔隙-小管系統之間的關系中所起的作用。
最后，由于Cxcl2是機械負荷后MLO-Y4骨細胞中上調最多的基因，因此RNAseq分析的一部分重點關注機械負荷對趨化因子表達的影響。機械應變誘導對照細胞（shRNA對照）中Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl9、Cxcl10和Csf1水平大幅增加。然而，YAP和TAZ的缺失消除了Cxcl3、Cxcl9、Cxcl10和Csf1水平的升高。為了確認在YAP/TAZ調節方面與趨化因子表達相關的RNAseq結果，實驗使用了實時qPCR分析，觀察到機械負荷確實增加了對照細胞中Csf1（M-CSF）、Cxcl3、Cxcl9和Cxcl10的水平（圖3）。沉默 YAP/TAZ 部分減弱了機械負荷后 Csf1 和 Cxcl3 的上調。相比之下，響應機械負荷上調的Cxcl10和Cxcl9表達不依賴于YAP/TAZ。這說明YAP/TAZ介導MLO-Y4骨細胞樣細胞系機械誘導的趨化因子表達。
圖3 通過RT-qPCR評估機械負荷后YAP/TAZ敲低對趨化因子表達的影響。
通過實時qPCR檢測YAP/TAZ缺失的MLO-Y4細胞中CSF-1 (M-CSF)、CXCL3、CXCL9和CXCL10 mRNA的表達。
在這項研究中，利用MLO-Y4細胞開發了一種創新的3D骨細胞樣細胞系培養壓縮系統，以探索機械負荷誘導的基因修飾，并確定YAP/TAZ信號是否在細胞中起機械敏感介質的作用。該實驗模型能夠在由I型膠原組成的3D培養中研究骨細胞的機械轉導，從而代表了一個更生理相關的環境，還允許應用機械壓縮水平，概括作用在骨骼上的不同力，例如張力、流體剪切力和壓縮力。
總之，該研究結果提供了第一個證據，證明YAP/TAZ在3D機械刺激后在骨細胞樣細胞中被激活并調節趨化因子表達。研究結果表明，YAP/TAZ代表骨細胞樣細胞中機械轉導的調節因子，還證明了，骨細胞MLO-Y4細胞是不同趨化因子的主要來源，特別是Cxcl3、Cxcl9和Cxcl10，這些趨化因子是在機械負荷下釋放的。
參考文獻：Zarka M, Etienne F, Bourmaud M, Szondi D, Schwartz JM, Kampmann K, Helary C, Rannou F, Haÿ E, Cohen-Solal M. Mechanical loading activates the YAP/TAZ pathway and chemokine expression in the MLO-Y4 osteocyte-like cell line. Lab Invest. 2021 Dec;101(12):1597-1604. doi: 10.1038/s41374-021-00668-5. Epub 2021 Sep 14. PMID: 34521992.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34521992/
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯系小編。感謝各位的瀏覽以及關注！
微信搜索公眾號“Naturethink”，了解更多細胞體外仿生培養技術及應用。
點擊了解
壓力培養|牽張應變|細胞流體剪切力|共培養|血管培養|平行平板流動腔|儀器|上海泉眾機電科技有限公司
細胞壓力加載裝置|細胞壓力刺激|細胞機械壓應力|細胞體外加力刺激裝置|細胞壓力加載實驗|仿生壓力細胞培養儀
YES相關蛋白（YAP）和具有PDZ結合基序的轉錄共激活因子（TAZ）首先在果蠅中被發現，被認為是發育過程中器官生長的主要調節因子。YAP/TAZ受到機械和細胞骨架信號的調節，并作為機械轉換器控制細胞命運，以響應細胞微環境的特性。YAP/TAZ與不同的成骨細胞發生信號通路相互作用，如轉化生長因子β/骨形態發生蛋白通路和Wnt/β-catenin信號通路。新出現的證據表明，YAP/TAZ在成骨細胞生成過程中的機械敏感性中起作用。以往研究還在骨細胞系MLO-Y4中證明，Piezo 介導機械轉導并誘導YAP / TAZ核易位以響應剪切應力。
鑒于這些發現，已經提出了YAP/TAZ在骨細胞中的潛在作用的問題，特別是在響應3D機械負荷時。因此，在法國巴黎拉里布瓦西埃醫院、巴黎大學健康學院及英國曼徹斯特曼徹斯特大學生物科學學院聯合研究的一項實驗中利用了一種新的承受壓縮應力的3D培養模型來表征骨細胞樣細胞系MLO-Y4在機械負荷下的反應。相關內容發表在 Laboratory Investigation 期刊題為“Mechanical loading activates the YAP/TAZ pathway and chemokine expression in the MLO-Y4 osteocyte-like cell line”。
首先，為了確定骨細胞樣細胞系響應機械負荷的最佳條件，實驗對MLO-Y4細胞使用了循環機械2D拉伸和3D壓縮。將循環或靜態拉伸應用于2D細胞培養模型，拉伸百分比、頻率、信號形式和拉伸持續時間是可調的，MLO-Y4培養物以0.3 Hz的正弦波形和3%伸長率進行接受9小時的等雙軸動態拉伸。此外，在體外壓縮裝置將3D MLO-Y4培養物置于0-40 kPa的循環壓縮下，以1 Hz的正弦波形持續9小時。與2D拉伸和卸載機械條件相比，3D培養壓縮激活了某些機械敏感基因，例如E11和COX2編碼Ptgs2（圖1 A）。因此，后續實驗選擇了3D骨細胞壓縮模型。
骨細胞樣細胞系MLO-Y4機械負荷導致YAP/TAZ通路的激活，如靶基因Ankdr1和Tead4的表達增加所示（圖1 B），免疫熒光進一步證實了YAP/TAZ信號的激活，并量化了核易位，這在機械負荷下增加（圖1 C）。3D壓縮不僅降低了Yap表達，而且增加了Taz表達（圖1 D）。此外，3D壓縮增強了YAP/TAZ的蛋白表達，從而表明YAP/TAZ蛋白的穩定（圖1 E）。為了確認體內骨細胞YAP / TAZ的表達，在6月齡的小鼠股骨中進行抗體標記，在皮質骨和小梁骨中均發現YAP/TAZ染色。
圖1 YAP/TAZ活化和核易位的分析。
接下來，通過RNAseq確定由作為骨細胞機械傳感過程一部分的YAP/TAZ調節的生物過程。首先篩選Yap/Taz shRNA敲低的細胞，基于Yap和Taz shRNA的沉默足以降低YAP/TAZ mRNA和蛋白質水平。
RNAseq分析證明，無論YAP/TAZ敲低如何，負荷成分占方差的大部分，這表明負荷因子的影響很大（圖2 A）。圖2 B-D顯示了MA 圖，即對數平均值（A值）與log2倍變化（M值）的對比圖。在對照細胞中，Cxcl2是機械負荷誘導的上調幅度最大的基因（圖2 B）。與YAP/TAZ缺失相比，3D負荷誘導了更多的富集基因（圖2 B），從而避免了由這些轉錄共激活因子沉默引發的離散基因譜。在機械負荷下，YAP或TAZ缺失的基因反應反應有一定的相似性，表明存在一定程度的富集。Fbn2是機械負荷下骨細胞中YAP和TAZ個體缺失下上調的基因之一。此外，YAP和TAZ的沉默是有效的，因為這兩種轉錄輔助因子都是下調最多的基因之一（圖2 C、D）。
圖2 主成分分析和MA（比率強度）圖。
此外，GO分析用于鑒定骨細胞樣細胞系MLO-Y4中機械負荷下由YAP/TAZ調節的生物過程。結果表明，TEAD1和TEAD2是通過YAP響應機械負荷而調節的主要基因之一，因為YAP的缺失突出了導致這些GO terms 的基因的改變。細胞加載后，與樹突形態發生相關的幾個GO terms 被突出顯示，從而提示YAP和TAZ在骨細胞功能與腔隙-小管系統之間的關系中所起的作用。
最后，由于Cxcl2是機械負荷后MLO-Y4骨細胞中上調最多的基因，因此RNAseq分析的一部分重點關注機械負荷對趨化因子表達的影響。機械應變誘導對照細胞（shRNA對照）中Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl9、Cxcl10和Csf1水平大幅增加。然而，YAP和TAZ的缺失消除了Cxcl3、Cxcl9、Cxcl10和Csf1水平的升高。為了確認在YAP/TAZ調節方面與趨化因子表達相關的RNAseq結果，實驗使用了實時qPCR分析，觀察到機械負荷確實增加了對照細胞中Csf1（M-CSF）、Cxcl3、Cxcl9和Cxcl10的水平（圖3）。沉默 YAP/TAZ 部分減弱了機械負荷后 Csf1 和 Cxcl3 的上調。相比之下，響應機械負荷上調的Cxcl10和Cxcl9表達不依賴于YAP/TAZ。這說明YAP/TAZ介導MLO-Y4骨細胞樣細胞系機械誘導的趨化因子表達。
圖3 通過RT-qPCR評估機械負荷后YAP/TAZ敲低對趨化因子表達的影響。
通過實時qPCR檢測YAP/TAZ缺失的MLO-Y4細胞中CSF-1 (M-CSF)、CXCL3、CXCL9和CXCL10 mRNA的表達。
在這項研究中，利用MLO-Y4細胞開發了一種創新的3D骨細胞樣細胞系培養壓縮系統，以探索機械負荷誘導的基因修飾，并確定YAP/TAZ信號是否在細胞中起機械敏感介質的作用。該實驗模型能夠在由I型膠原組成的3D培養中研究骨細胞的機械轉導，從而代表了一個更生理相關的環境，還允許應用機械壓縮水平，概括作用在骨骼上的不同力，例如張力、流體剪切力和壓縮力。
總之，該研究結果提供了第一個證據，證明YAP/TAZ在3D機械刺激后在骨細胞樣細胞中被激活并調節趨化因子表達。研究結果表明，YAP/TAZ代表骨細胞樣細胞中機械轉導的調節因子，還證明了，骨細胞MLO-Y4細胞是不同趨化因子的主要來源，特別是Cxcl3、Cxcl9和Cxcl10，這些趨化因子是在機械負荷下釋放的。
參考文獻：Zarka M, Etienne F, Bourmaud M, Szondi D, Schwartz JM, Kampmann K, Helary C, Rannou F, Haÿ E, Cohen-Solal M. Mechanical loading activates the YAP/TAZ pathway and chemokine expression in the MLO-Y4 osteocyte-like cell line. Lab Invest. 2021 Dec;101(12):1597-1604. doi: 10.1038/s41374-021-00668-5. Epub 2021 Sep 14. PMID: 34521992.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34521992/
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯系小編。感謝各位的瀏覽以及關注！
微信搜索公眾號“Naturethink”，了解更多細胞體外仿生培養技術及應用。
點擊了解
壓力培養|牽張應變|細胞流體剪切力|共培養|血管培養|平行平板流動腔|儀器|上海泉眾機電科技有限公司
細胞壓力加載裝置|細胞壓力刺激|細胞機械壓應力|細胞體外加力刺激裝置|細胞壓力加載實驗|仿生壓力細胞培養儀
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com