接上回，在單細胞轉(zhuǎn)錄組 | 聚類分析中的機器學(xué)習(xí)與統(tǒng)計方法綜述（一）和單細胞轉(zhuǎn)錄組 | 聚類分析中的機器學(xué)習(xí)與統(tǒng)計方法綜述（二）中，綜述了在過去幾年間發(fā)展起來的，用于單細胞轉(zhuǎn)錄組分析中聚類的機器學(xué)習(xí)和統(tǒng)計方法，重點介紹了如何將一些常見的聚類方法，如層次聚類、基于圖的聚類、混合模型、k-means、集成學(xué)習(xí)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和基于密度的聚類等加以調(diào)整及應(yīng)用，從而解決單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中的獨特挑戰(zhàn)，例如低表達基因的缺失，轉(zhuǎn)錄本的不均勻覆蓋，以及由技術(shù)偏差和不相關(guān)的混雜生物變異所帶來的細胞標(biāo)記的失真。我們評價了標(biāo)準化、dropouts推測以及降維等預(yù)處理步驟如何提高聚類效果。

本文將繼續(xù)介紹一些能夠?qū)�時間序列樣本和多個細胞群進行聚類并且檢測罕見細胞類型的新方法。最后，對部分開發(fā)用于單細胞轉(zhuǎn)錄組聚類分析的軟件進行了實驗和比較，以評估其性能和效率，為未來的數(shù)據(jù)分析提供一定的指導(dǎo)和方向。

01 罕見細胞類型及單個細胞類群

在單細胞的聚類分析中，罕見細胞類型的檢測是一個重要問題，因為在發(fā)育或疾病進展中起重要作用的細胞類型往往豐度較低。由于罕見細胞類型的群體規(guī)模小，在標(biāo)準的聚類分析中往往難以檢測到。

RaceID是專門用于從單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中識別稀有細胞類型的一種聚類工具。該工具首先計算細胞間Pearson相關(guān)性用于k-means聚類。在每個類群中，根據(jù)和背景噪聲模型相比的基因的變異型篩選離群細胞。最后，如果離群細胞的相關(guān)性超過原始聚類中細胞間相關(guān)性的閾值，則將離群細胞合并到離群簇中。

GiniClust是另一個聚焦于罕見細胞發(fā)現(xiàn)的聚類工具。在算法中使用基尼系數(shù)進行特征基因的選擇。與常用的Fano因子相比，這種方法對細胞總量占比較低的細胞群體更加敏感。最后，利用基尼系數(shù)篩選得到的基因作為特征進行DBSCAN密度聚類，檢測稀有細胞類型。

屬于稀有細胞類型的細胞也可以被視為聚類過程中產(chǎn)生的異常值。在大多數(shù)已公開的單細胞聚類算法中，都可以生成數(shù)量相對較小的簇，甚至該簇中只包含一個細胞。雖然這可能是由于聚類算法的初始化或收斂性差造成的，但它也可以被解釋為來自罕見細胞類型的異常細胞。一些算法或工具包含特定的技術(shù)和參數(shù)，能夠進行罕見細胞類型的檢測。以使用層次聚類的SINCERA為例，它不要求用戶指定簇之間的最小距離，而是使用允許的最低細胞數(shù)量的閾值。

02 細胞Marker基因的檢測

聚類分析的另一個重要目的是發(fā)現(xiàn)新的Marker基因，以描述通過聚類發(fā)現(xiàn)的每種細胞類型的基因表達模式和功能，從而用于未來的生物學(xué)解釋和實驗驗證。大多數(shù)方法是在聚類后通過對不同類群之間的差異表達基因進行統(tǒng)計檢驗分析來識別Marker。例如，Seurat使用Wilcoxon秩和檢驗，這是一種基于排序表達值中秩次統(tǒng)計量的非參數(shù)檢驗方法。在SINCERA中，當(dāng)樣本容量較小，同樣使用秩和檢驗，當(dāng)樣本容量變大時則使用Welch’s t檢驗。

除了上述方法是將差異表達分析作為聚類的后處理步驟，還有一些則是在聚類的過程中同時進行Marker基因的檢測。BackSPIN計算每次分裂后每個簇中的平均基因表達量，并將每個基因分配到表達量最高的簇中。DendroSplit通過Welch’s t檢驗識別p值最顯著的Marker基因作為類群分離評分，以決定是否需要在層次聚類中進一步拆分分支。SAIC使用k-means對細胞進行聚類的同時，利用方差分析選擇Marker基因。

03 方法評估

在本節(jié)中，我們對單細胞轉(zhuǎn)錄組的聚類方法進行了兩次實驗評估。在第一個實驗中，我們使用人外周血單細胞數(shù)據(jù)，比較了幾種廣泛使用的單細胞聚類工具或方法，以確定不同方法的優(yōu)勢和局限性。在第二個實驗中，我們對來自5個個體的212個乳腺癌細胞進行了聚類，以評估不同的工具在不同批次來源的多個細胞群中的聚類性能。

● 人外周血數(shù)據(jù)  

我們從10x Genomics網(wǎng)站下載了PBMC數(shù)據(jù)，在原始數(shù)據(jù)中總共包含了103887個細胞。除了使用整個數(shù)據(jù)集去進行方法的比較外，我們還對原始數(shù)據(jù)按照不同大小（100，1000，10000）進行向下采樣以評估其延展性。數(shù)據(jù)集最初包含32739個表達基因，我們從中選擇了至少在3個細胞中表達的19630個基因。（使用的計算機參數(shù)：Intel Xeon E52687W v3 3.10GHz, 25 M Cache and 256 GB of RAM）。

Figure 5. PBMC中聚類方法的比較

(A)Y軸表示ARI值，X軸表示不同的測試數(shù)據(jù)集。其中不同顏色代表了不同的工具或方法。(B)Y軸表示運行時間，X軸同圖A。曲線截斷表明該方法在相應(yīng)數(shù)據(jù)集下不再適用。
 

如圖5所示，通過對10次不同的運行結(jié)果取均值和標(biāo)準差，對ARI和運行時間進行了比較。結(jié)果表明，在這些方法中，Monocle、cellTree、Seurat和SC3的表現(xiàn)最好。但是，由于內(nèi)存問題，Monocle、cellTree和Seurat不能擴展到所有的測試數(shù)據(jù)集。SC3的算法中，最多對5000個細胞進行聚類，剩余的細胞則通過構(gòu)造一個支持向量機（SVM）完成。而除去這一監(jiān)督學(xué)習(xí)的步驟，SC3的表現(xiàn)和cellTree、Seurat相似。pcaReduce能夠應(yīng)用于所有的數(shù)據(jù)集，但運行時間超過2天（圖5B），同時聚類結(jié)果并沒有因為數(shù)據(jù)集包含細胞數(shù)的增多而得到改善（圖5A）。SCRAT包在對100個細胞時進行聚類時表現(xiàn)良好，但當(dāng)使用40個單元（此處單元表示具有相關(guān)基因表達的細胞）聚類1000個細胞時變得不穩(wěn)定。此外，該工具至少需要3天時間來處理5000個細胞的數(shù)據(jù)集，因此不能擴展到更大的數(shù)據(jù)集。

圖5A還顯示，SC3和pcaReduce等使用k-means作為聚類步驟之一的工具在多次運行中的方差最大，而使用層次聚類的工具cellTree、CIDR和DendroSplit，使用基于圖聚類方法的工具SNN-Cliq和基于密度的聚類工具Monocle在多次運行中總是保持相同的聚類結(jié)果。混合模型TSCAN和Seurat以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法SCRAT也返回相同的聚類結(jié)果，這表明在聚類實現(xiàn)的過程中使用了一些固定的初始化策略。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，基于層次聚類的方法顯示出非常接近的平均ARI結(jié)果。當(dāng)聚類1000個細胞時，我們可以看到BackSPIN、CIDR、DendroSplit和ICGS的ARI值大約在0.25到0.3之間。cellTree雖然也是基于層次聚類，但應(yīng)用了LDA對數(shù)據(jù)進行降維，這似乎更適用于原始計數(shù)數(shù)據(jù)。在基于劃分的聚類方法上，我們可以看到，盡管pcaReduce使用k-means作為其框架的一部分，但通過正確使用PCA和聚類的合并策略，能夠顯著改善聚類的結(jié)果。SC3看起來是一種前景不錯的方法，它結(jié)合了幾種不同的距離測量和映射方法的優(yōu)點，然而，當(dāng)數(shù)據(jù)集增大，即SC3開始依賴SVM對更多的細胞進行分類時，結(jié)果似乎是不穩(wěn)定的，例如聚類10000個細胞的結(jié)果要差于聚類1000個細胞的結(jié)果。使用GMM的TSCAN在大數(shù)據(jù)集中表現(xiàn)出比k-means更好的結(jié)果，這表明高斯混合模型可能在聚類中發(fā)揮更好地積極推動作用。對于基于密度的聚類，Monocle在聚類10000個細胞時的性能優(yōu)于其他方法。最后，盡管Seurat和SNN-Cliq都建立了SNN作為聚類的基礎(chǔ)，但是前者的總體表現(xiàn)更優(yōu)，可能是因為Seurat使用了Louvain算法，而SNN-Cliq則是基于團檢測的方法。

這個實驗表明，即使有大量的專門為單細胞分析所開發(fā)的聚類方法，它們在聚類數(shù)千個細胞時的結(jié)果顯示出相當(dāng)大的變化。并且我們?nèi)匀恍枰�一些方法，這些方法不像SC3那樣依賴于監(jiān)督學(xué)習(xí)，就能夠應(yīng)用于大型數(shù)據(jù)集，例如數(shù)十萬個細胞或者更多。

● 乳腺癌數(shù)據(jù)  

我們從公共數(shù)據(jù)中下載得到了來源于11名乳腺癌患者共515個細胞的數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含了25636和基因的TPM表達值，我們從中提取了5000個高變基因進行此次分析。這些細胞總體包含三類：免疫細胞、基質(zhì)細胞和腫瘤細胞。由于一些患者的數(shù)據(jù)未覆蓋到全部三種類型，因此，我們最后使用了來自5名患者的212個細胞作為此次實驗的對象。

該數(shù)據(jù)集的主要目的是用于比較兩個適用于混合樣本聚類的工具。首先，Seurat主要通過CCA的方法對來自不同患者的數(shù)據(jù)進行整合。運行Seurat時，我們選取了幾個不同的參數(shù)：特征基因數(shù)量分別為{3000,3200,...,5000}，典型相關(guān)成分{2,...,10}，分辨率{0.2,0.3,0.4,0.5}。通過幾種不同的組合分析，我們最終發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)最優(yōu)的組合是1600+2+0.2，分別對應(yīng)上面三個參數(shù)。scVDMC在數(shù)學(xué)優(yōu)化框架中使用內(nèi)嵌的特征選擇來尋找一小組共享的基因以整合數(shù)據(jù)集。我們同樣選取不同的參數(shù)進行組合，最后得到的最優(yōu)組合是λ = 1000，α = 3，w = 3。

Figure 6 BRCA中聚類方法的比較

(A)Y軸表示ARI值，X軸表示不同工具和數(shù)據(jù)集的組合。(B)同圖A。

我們也將這兩個工具和上一節(jié)中表現(xiàn)最好的Monocle，SC3以及cellTree在兩個層面進行了比較：按照樣本來源分離單獨進行聚類；合并樣本聚類。圖2展示了比較的結(jié)果。從圖6A中我們可以看到，SC3和cellTree在合并聚類的得分中要差很多，提示我們簡單的合并樣本不適用于整合多個不同來源的單細胞數(shù)據(jù)。我們還注意到scVDMC和Seurat都獲得了較高的ARI。其中，scVDMC的平均值為0.681，Seurat的平均值為0.675。盡管scVDMC的均值更高，但其方差也比較大，與Seurat的差異并不具有統(tǒng)計學(xué)意義（p=0.3511）。另外，scVDMC相較于Seurat擁有更少的運行時間（p=2E-14）。總的來說，這些結(jié)果表明對于混合的樣本使用內(nèi)置批次矯正方法（如包含CCA的Seurat）的工具更為有效。

04 討論

在過去的幾年里，專門用于單細胞數(shù)據(jù)分析的聚類算法已經(jīng)有了實質(zhì)性的發(fā)展。這些算法旨在解決單細胞數(shù)據(jù)中固有的挑戰(zhàn)，例如細胞特異性偏差、dropouts和技術(shù)噪聲。一些用于解決特定情況（批次、罕見細胞、時間序列）的工具已經(jīng)被開發(fā)出來。此外，不同的方法也越來越關(guān)注數(shù)據(jù)的預(yù)處理，如標(biāo)準化、降維和相似性度量等，這些方法有助于減少執(zhí)行聚類前的技術(shù)差異。總之，這些計算方法的進步為單細胞數(shù)據(jù)的聚類分析提供了非常大的幫助。

我們也注意到，由于單細胞平臺的發(fā)展，細胞捕獲和測序的成本及時間也越來越低，捕獲的細胞數(shù)量越來越高。因此，越來越多的研究更需要擴展性良好的聚類工具或方法，以便能夠在更大的數(shù)據(jù)集中進行使用。而這一發(fā)展也為分析帶來了新的挑戰(zhàn)，大多數(shù)現(xiàn)有的工具都無法很好地應(yīng)用到數(shù)萬個甚至更多的單細胞數(shù)據(jù)，所以也限制了部分算法在未來研究中的適用性。

另一個現(xiàn)有方法的缺陷是關(guān)于數(shù)據(jù)的整合。如今，單細胞數(shù)據(jù)集仍然在不斷地快速增長，這些開放的大量數(shù)據(jù)將會使我們對特定細胞類型、細胞標(biāo)記、表達模式等擁有更深的了解。此外，這些數(shù)據(jù)還有助于構(gòu)建大規(guī)模不同疾病隊列的單細胞圖譜。然而，目前的聚類方法中，很少有專門應(yīng)用于多數(shù)據(jù)的合并聚類分析，往往需要借助其它工具的使用。

除了本文中主要描述的無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法之外，還有一種使用監(jiān)督或半監(jiān)督學(xué)習(xí)方式來進行細胞聚類的替代方法。例如，SC3包使用監(jiān)督學(xué)習(xí)將多余的細胞分配給通過共識聚類發(fā)現(xiàn)的簇，提高了其在大數(shù)據(jù)集應(yīng)用上的延展性。再比如，當(dāng)有一個已知類別的參考數(shù)據(jù)集時，通過Scmap，可以將其他數(shù)據(jù)集中未知的細胞比對到該參考數(shù)據(jù)集中最相似的細胞，從而實現(xiàn)細胞的聚類。

最后，除了單細胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)之外，更多不同類型的單細胞組學(xué)方法也呈現(xiàn)風(fēng)靡之勢。盡管面對新類型的單細胞數(shù)據(jù)，現(xiàn)有的方法仍然部分適用。但是在未來，也迫切需要應(yīng)對多組學(xué)整合聚類的新的計算方法。

參考文獻

[1] https://blog.bioturing.com/2022/01/27/a-guide-to-scrna-seq-normalization

[2] Campigotto, Romain & Conde-Céspedes, Patricia & Guillaume, Jean-Loup. (2014). A Generalized and Adaptive Method for Community Detection.

[3] Kiselev, V., Kirschner, K., Schaub, M. et al. SC3: consensus clustering of single-cell RNA-seq data. Nat Methods 14, 483–486 (2017).

[4] Stuart T, Butler A, Hoffman P, Hafemeister C, Papalexi E, Mauck WM 3rd, Hao Y, Stoeckius M, Smibert P, Satija R. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 2019 Jun 13;177(7):1888-1902.e21.