1.什么是CRISPR/Cas9敲除細胞系
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是新出現的一種由sgRNA指導Cas核酸內切酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。CRISPR/Cas9系統廣泛存在于原核生物基因中，是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的一種適應性免疫防御機制。
 
2.CRISPR/Cas9敲除細胞系的原理
CRISPR/Cas系統分為兩大類，最典型和應用最廣泛的 CRISPR 系統是 II 型 CRISPR/Cas9 系統。在II型CRISPR系統中，CRISPR RNA（crRNA）通過堿基配對與轉錄激活crRNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）退火形成能夠特異識別基因組序列的復
合體，然后通過PAM（5’-NGG-3’）序列結合并侵入DNA，引導Cas9核酸內切酶在目的片段切割使DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSBs）。 
   
 
3.CRISPR/Cas9敲除細胞系的服務優勢
（1）具有編輯效率高、構建簡單、操作方便等優點
（3）能夠成本低廉地實現有效靈活的基因敲除
（4）具有廣譜性，無基因、細胞及物種限制
（5）可實現多個靶位點同時進行基因打靶
（6）功能豐富，可實現敲除、插入、抑制、激活等多種目的基因
4.CRISPR/Cas9敲除細胞系主要應用方向
CRISPR/Cas9敲除細胞系廣泛應用于許多領域，特別是在遺傳疾病治療、疾病相關基因的篩選和檢測、腫瘤治療、動植物轉化以及病原微生物的預防等領域具有巨大的潛力，可以有效改善人類的生活質量。
5.CRISPR/Cas9敲除細胞系面對的挑戰
盡管之前的解釋表明 CRISPR/Cas9 是一種很有前途的方法，但這種編輯系統仍然存在許多局限性和風險，由于其最近在人類中的發現和使用，使其在臨床試驗中的使用具有挑戰性。免疫原性、脫靶、多態性、遞送技術和倫理問題是主要的限制和困難。
6.CRISPR/Cas9敲除細胞系的全流程介紹
CRISPR/Cas9敲除細胞系，主要流程如下：gRNA設計，細胞轉染，單細胞克隆，單克隆篩選，單克隆測序分析，交付報告。

 
 
6.1 gRNA設計
6.1.1用 BbsI 在 37℃條件下酶切載體質粒 pAC1371。
6.1.2參照DNA 片段回收試劑盒說明書回收目的載體。
6.1.3引物退火
使用以下參數在 PCR 環儀中進行退火:

試劑	使用量
Oligo 1（100μM）	1.0
Oligo 2（100μM）	1.0
ddH2O	7.5
T4 PNK(NEB)	0.5
Total	10

 
37℃ 30 分鐘，95℃ 5 分鐘，然后以每分鐘降低 5℃的速度將溫度降到 25℃。
6.1.4連接酶連接。
6.1.5質粒轉化（Transformation）
（1）取DH5a 感受態細胞放在冰上解凍，解凍后將5-10µL連接產物添加到感受狀態細胞中，用槍頭輕輕攪拌均勻(切勿劇烈震動)，在冰箱中靜置孵化25-30分鐘。
（2）將感受態細胞放入冰上孵化后，提前調節溫度至42℃的水浴鍋中，加熱90秒。
（3）加入 500μL 提前預熱至室溫的液體培養基，置于 37℃搖床中復蘇搖菌 1 小時。
（4）3000 轉離心 3 分鐘，棄掉部分上清液，用滅菌冷卻至室溫的玻璃棒涂板，置于 37℃培養箱中過夜生長。
（5）隨機挑取獨立生長的菌斑于液體培養基中培養 6-8 小時，進行菌落 PCR。
（6）將 PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像儀成像，選取陽性菌落送去測序公司進行測序鑒定。
（7）根據測序結果選取目的菌落擴大培養，提取質粒，備后續實驗室用。
 
6.2細胞轉染
6.2.1準備：細胞準備，將長勢良好 HEK293T 細胞按一定數量傳代。
6.2.2將長勢良好，密度適當的 HEK293T 細胞更換一半新鮮培養基。
6.2.3 pMD2.G: 1µg+paspax2: 1µg +transgene: 2µg+optimem: 0.126mL 混勻，室溫靜置5 分鐘， lipofectamine 2000：8µL+optimem: 0.125mL 混勻，室溫靜置 5 分鐘。
6.2.4  5 分鐘后將步驟 5.2 .3中的兩種混合物輕柔的混合在一起，室溫靜置 15 分鐘。
6.3單細胞克隆
100 個細胞鋪在一個大盤或 96 孔板中。剩余的細胞凍存。當肉眼可見類似于菌落的細胞團時，將其從大盤或 96 孔板消化下來轉移至 12 或 24 孔板中繼續擴大培養。注意不要污染到其它細胞團，不要選取過密的細胞團。
6.4單克隆篩選
使用特定的篩選標記，如熒光蛋白或抗生素抗性基因，也可以幫助篩選成功敲除目標基因的克隆。
6.5單克隆測序分析
使用聚合酶鏈式反應（PCR）來擴增目標基因的DNA序列，并通過凝膠電泳或測序技術來檢測是否存在突變或缺失。