文獻解讀：單細胞水平結直腸癌肝轉移的時空免疫圖譜
導讀
肝轉移仍然是結直腸癌患者長期生存的主要障礙，也是癌細胞的高度動態擴散途徑。除癌細胞外，肝轉移的腫瘤微環境(TME)具有高度的免疫抑制表型，誘導抗原特異性T淋巴細胞的全身性損失，并推動腫瘤的擴散。目前仍不清楚免疫細胞如何在空間上協調結直腸癌肝轉移(CRLM)進展及轉移細胞微環境是否與原發細胞不同。因此，迫切需要記錄、識別和量化CRLM的細胞甚至空間景觀，以刷新我們對轉移生物學的理解。
科學問題
利用單細胞測序和空間轉錄組技術探索結直腸癌肝轉移（CRLM）的免疫圖譜，研究腫瘤微環境在原發位點和轉移位點之間的變化情況。同時探究新輔助化療（NAC）對腫瘤微環境（TME）改變的確切影響。
實驗設計
來自20個患者89例樣本進行單細胞轉錄組測序（scRNA-seq），對來自4個患者8例樣本進行空間轉錄組測序（ST）。
技術：scRNA-Seq、ST、mIHC（多色熒光免疫組化）
實驗思路
實驗結果
1. 整合單細胞和空轉數據量化可切除CRLM樣本中免疫細胞多樣性
文章對20例患者89個樣本進行scRNA-seq, 4例患者8個樣本進行ST測序，其中13例患者54個樣本treatment-naive, 6例患者30個樣本行新輔助化療部分緩解(PR)，5例患者中13例為病情進展(PD)或病情穩定的新輔助化療患者(SD)。所有腫瘤都是微衛星穩定的。文章整合了所有178,630個CD45+細胞，進行了聚類分析，并使用SingleR和細胞標記基因定義了主要的細胞類型。我們從CRLM樣本中鑒定出髓細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、自然殺傷(NK)細胞和B細胞。值得注意的是，T細胞比例在不同的組織類型中明顯不同，這表明免疫微環境的組織異質性。結直腸癌和成對肝轉移均顯示CD45+細胞中約10%的調節性T細胞(Treg)，而在鄰近正常組織中這種細胞很少。這表明腫瘤內免疫受到抑制，以前認為這是由于肝轉移的免疫治療效果降低。
同時，兩名未治療患者和兩名NAC-PR患者的8個樣本(配對結直腸癌和肝轉移)的ST數據進行分析。無監督聚類分析將樣本劃分為不同的區域，如腫瘤區和成纖維細胞區(下圖F)。為了整合scRNA-seq和ST數據，文章使用Seurat來量化主要的免疫亞群。在未處理的樣本中，我們觀察到與scRNAseq一致的免疫細胞模式，如CD8+ T細胞在肝轉移和結直腸癌中顯著富集(下圖G)。相比之下，在NAC處理的樣本中，觀察到腫瘤區域更小，免疫細胞分布不規則。特別是在肝轉移中，只有一小部分斑點聚集成癌細胞，說明NAC治療后細胞間隔發生了根本性的重塑。綜上所述，這些結果突出了NAC處理后的CRLM患者免疫細胞的時空動態格局巨大的重塑。
2.轉移性腫瘤富集免疫抑制細胞，尤其是MRC1+CCL18+M2-like巨噬細胞
考慮到患者的細胞組成不同，文章使用scDC來估計細胞比例，過濾了低豐度的免疫細胞，聚類免疫細胞比例(下圖A)。在未處理的樣本中，免疫細胞豐度可分為六種不同的模式(鄰近結直腸癌高、結直腸癌高、鄰近肝臟高、LM高、結直腸癌高和肝臟高)。鄰近的結直腸癌樣本顯示AIM2+記憶B細胞、TCLIA+-naive B細胞和CD4+-naive T細胞比例最高，而結直腸癌樣本大多富集FOXP3+ Tregs。MAIT細胞、NK細胞和FGFBP2+GZMB+ CD8+ T細胞在鄰近的正常肝組織中富集。相反，肝轉移中特異性存在一些免疫抑制細胞，其中SPPI+巨噬細胞和MRCI+ CCL18+巨噬細胞急劇增加(圖2B)。文章發現MRCI+CCL18+巨噬細胞具有Kupffer細胞特征，這表明它們可能來源于肝Kupffer細胞。中性粒細胞，據報道作為潛在的原體參與者，也在肝轉移中富集(下圖B)。我們進一步使用單樣本基因集富集分析(ssGSEA)來量化免疫細胞亞群的空間分布。結果發現MRCI+ CCL18+巨噬細胞和SPP1+巨噬細胞在未經治療的肝轉移中富集(下圖C)。這些數據與scRNA-seq的數據部分一致，進一步證實了肝轉移的潛在抑制性TME。
文章使用多重免疫組化(mIHC)對另外27例CRLM患者(n = 18，未經治療;n = 9, NAC-PR)。在未經處理的樣本中，觀察到FOXP3+ Tregs、MRC1+ CCL18+巨噬細胞和SPP1+巨噬細胞在結直腸癌和肝轉移中的浸潤顯著增加，這與scRNA-seq數據基本一致(圖F)。其次，文章利用ssGSEA對CRLM的批量微陣列數據集中的免疫細胞進行評分。文章檢查了原發腫瘤和轉移性腫瘤之間的細胞豐度。在該驗證隊列中，MRCI+ CCL18+巨噬細胞、SPP1+巨噬細胞和中性粒細胞在轉移性腫瘤中均顯著升高。TCGA數據隊列中原發腫瘤中MRC1+CCL18+巨噬細胞和SPP1+巨噬細胞的高評分均預示預后明顯較差。推測特定的巨噬細胞亞群可能在CRLM中原生細胞生態位的形成中起著重要作用。
3. 轉移性腫瘤中巨噬細胞轉向抑制狀態
鑒于肝臟轉移中巨噬細胞亞群的富集，文章假設這些肝臟轉移富集的巨噬細胞在不同的組織中可能具有不同的功能。因此，我們進行基于配體受體的癌癥免疫串擾分析，比較原發和轉移部位。結果顯示SPP1+巨噬細胞和MRC1+ CCL18+巨噬細胞在肝轉移和結直腸癌的所有不同的交叉通話細胞類型中排名較高。這一結果表明，肝轉移性癌細胞可能會優先重編程巨噬細胞并誘導其特定的功能狀態(下圖A)。值得注意的是，肝轉移中的轉移性腫瘤細胞優先表達配體CD47。文章進一步利用mIHC對這些蛋白進行共表達可視化。這些配體受體對特異性富集于肝轉移，為靶向治療肝轉移提供了線索。
為了精確定位特異的TME印跡的差異，文章在結直腸癌和肝轉移巨噬細胞之間進行了差異基因表達分析。APOE和其他M2極化相關基因如MARCO也在肝轉移富集的MRC1+CCL18+巨噬細胞中顯著上調(下圖E)。相比之下，富集于結直腸癌的MRC1+CCL18+巨噬細胞具有更高水平的炎性細胞因子表達，包括TNF、ILIB、CCL3和CCL4。通路富集分析顯示(下圖F)，在結直腸癌和肝轉移的MRC1+ CCL18巨噬細胞中，代謝通路都顯著富集，突出了代謝在決定這些巨噬細胞功能中的基本作用。值得注意的是，文章發現結直腸癌中MRC1+ CCL18t巨噬細胞富集氧化磷酸化，而肝轉移中MRC1+ CCL18t巨噬細胞以氨基酸代謝為主。這些數據強調，代謝調節可能介導巨噬細胞的表型和功能轉移，以響應不同的微環境改變。
4. 在肝轉移中MRC1+CCL18+巨噬細胞代謝活性急劇增加
為了了解髓系細胞在CRLM中的代謝圖景，文章通過scMetabolism計算抑制性巨噬細胞和單核細胞在每一條代謝通路中的活性得分。結果顯示肝轉移浸潤的MRC1+ CCL18+巨噬細胞在所有髓系細胞中表現出最高的代謝活性，表明它們非常有活力，這可能與它們在轉移部位的獨特功能有關。進一步對MRC1+ CCL18+巨噬細胞的所有代謝相關基因進行無監督聚類，觀察到與周圍組織相關的強烈代謝偏好，在結直腸癌和肝轉移浸潤的MRC1+ CCL18+巨噬細胞中鑒定出42種可能上調的代謝途徑。差異表達的代謝基因并發現原發性和轉移性浸潤的MRC1+ CCL18+巨噬細胞中代謝基因特異性上調。ILAI1和MIF是巨噬細胞激活所必需的基因也表現出類似的特征。文章使用mIHC驗證了這些代謝酶，觀察到基本一致的結果。結果表明代謝在決定MRC1+ CCL18+巨噬細胞表型中起著重要作用。
5. NAC響應與非響應性腫瘤包含獨特的免疫動態
為了探索NAC對抗腫瘤免疫的影響，文章使用TooManyCells對所有CD45+細胞進行了聚類分析。結果表明結直腸癌和肝轉移的細胞聚類有明顯的差異（下圖A）。NAC對TME的影響具有高度的細胞類型特異性和環境依賴性（下圖B\C）。通常，在PR腫瘤中，NAC可以下調免疫抑制細胞并激活細胞毒性細胞。在肝轉移中，反應性NAC下調了SPP1+巨噬細胞，上調了GZMK+ CD8+ T細胞和XCL1+ CD8+ T細胞等細胞毒性T細胞，特別是在NAC- pr腫瘤中保留了幾個MRC1t+CCL18+巨噬細胞和幾十個SPP1+巨噬細胞，提示NAC在抑制巨噬細胞譜系中的潛在作用。然而，在PD/SD腫瘤中，存在與PR腫瘤不同的免疫細胞變化。例如，肝轉移中SPP1t巨噬細胞和MRC1+ CCL18+巨噬細胞水平升高，而細胞毒性免疫細胞(即FGFBP2+GZMB+CD8+ T細胞)水平下調(下圖C、E和F)。這些相反的結果可能是由器官特異性和治療療效相關的癌細胞重塑所解釋的。總之，這些結果表明，有效的NAC不僅能重編程腫瘤內免疫平衡，還能激活全身抗腫瘤免疫反應，為支持NAC在可切除的CRLM中的潛在應用提供了證據。
結論
本文使用scRNA-seq和ST.定義了CRLM的細胞和空間免疫景觀。數據顯示，在肝轉移中，免疫微環境經歷了廣泛的時空重塑，免疫抑制細胞顯著富集，這與之前基于大量樣本的研究一致。特別是，MRC1+ CCL18+巨噬細胞表現為終末分化狀態，表現為代謝活躍的表型，對新輔助化療敏感。該研究不僅揭示了以前未被認識到的CRLM免疫生態系統的多樣性，而且為癌癥研究界提供了更為全面的資源。
參考文獻：
Wu Y, Yang S, Ma J, Chen Z, Song G, Rao D, Cheng Y, Huang S, Liu Y, Jiang S, Liu J, Huang X, Wang X, Qiu S, Xu J, Xi R, Bai F, Zhou J, Fan J, Zhang X, Gao Q. Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level. Cancer Discov. 2022 Jan;12(1):134-153. doi: 10.1158/2159-8290.CD-21-0316. Epub 2021 Aug 20. PMID: 34417225.
