目前病毒是導(dǎo)致全球范圍內(nèi)兒童肺炎最主要的病原菌之一，因此能夠快速和準(zhǔn)確的診斷病毒性肺炎是早期干預(yù)阻止病情進(jìn)展的重要措施。但是病毒性肺炎和其他諸如細(xì)菌、肺炎支原體等引發(fā)的肺炎在臨床表型上很難區(qū)分，病原菌檢測(cè)有一定程度的滯后性，所以尋找可以替代診斷的生物標(biāo)志物是臨床診斷兒童肺炎的迫切需求。

前期的多項(xiàng)研究表明尿液外泌體可以作為診斷和評(píng)估很多疾病的潛在標(biāo)志物。并且蛋白組學(xué)也揭示了尿液外泌體富含很多免疫相關(guān)分子¹。因此探究尿液外泌體在感染性疾病中的潛在應(yīng)用具有很大的價(jià)值。2023年1月12日，兒科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的權(quán)威期刊Pediatric Research在線發(fā)表了上海兒童醫(yī)學(xué)中心聯(lián)合華盈生物共同開(kāi)展的基于肺炎兒童尿液外泌體蛋白組的生物標(biāo)志物研究成果²。

本項(xiàng)研究分為發(fā)現(xiàn)集和驗(yàn)證集，納入了正常兒童、肺炎支原體肺炎兒童和病毒性肺炎兒童。發(fā)現(xiàn)階段利用Exosome Isolation Q3 試劑盒提取尿液外泌體，進(jìn)行l(wèi)abel free蛋白組學(xué)。結(jié)果鑒定了1621個(gè)蛋白（unique peptides >2），結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，排除與尿液高豐度蛋白THP共富集的蛋白組分以及可溶性蛋白組分后，總共1246個(gè)被認(rèn)為是高可信的尿液外泌體蛋白，其中79%的蛋白可在外泌體蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)Exocarta檢索到，典型的外泌體marker: CD9, CD81, TSG101, PDCD6IP (ALIX) 和CD63可在50%-100%的樣本中被鑒定到，這些結(jié)果說(shuō)明了高質(zhì)量的尿液外泌體提取和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)（圖1）。

圖1 尿液外泌體的蛋白組學(xué)
 

PCA分析揭示了病毒性肺炎兒童的尿液外泌體蛋白組與肺炎支原體肺炎兒童和健康兒童間存在很顯著的差異，特別是響應(yīng)病毒感染的干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs)編碼的蛋白顯著富集在病毒性肺炎兒童的尿液外泌體中，并且部分病毒受體例如ACE2,ANPEP, DPP4 和 LAMP1在病毒性肺炎兒童的尿液外泌體中的表達(dá)高于健康兒童。我們又進(jìn)一步的對(duì)260個(gè)與病毒感染相關(guān)的顯著差異蛋白進(jìn)行了功能富集分析，發(fā)現(xiàn)了這些差異蛋白參與到病毒感染和肺部感染的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程和通路中，例如中性粒細(xì)胞活性、內(nèi)吞、胞外基質(zhì)、糖基化等代謝通路等（圖2）。這些結(jié)果證實(shí)了尿液外泌體確實(shí)可以反映出宿主響應(yīng)病原菌感染的分子變化，可以作為感染性疾病診斷的潛在標(biāo)志物來(lái)源。

圖2 尿液外泌體蛋白組學(xué)的功能分析

在本研究的初步驗(yàn)證階段，我們又另外納入了20名健康兒童、12名病毒性肺炎兒童和17名肺炎支原體肺炎兒童，同樣利用Exosome Isolation Q3 試劑盒提取尿液外泌體開(kāi)展基于多重反應(yīng)監(jiān)視（multiple reaction monitoring，MRM）的靶向蛋白組學(xué)分析。我們選擇了33個(gè)與病毒感染相關(guān)的差異性蛋白，結(jié)果19個(gè)蛋白可被MRM成功檢測(cè)到，定量分析發(fā)現(xiàn)了其中8個(gè)蛋白 (ANPEP, ASAH1, COL11A1, EHD4, HEXB, LGALS3BP, SERPINA1, SERPING1)的13個(gè)多肽只在病毒性肺炎兒童中顯著高于健康兒童，說(shuō)明了這8個(gè)蛋白可作為診斷兒童病毒性肺炎的潛在標(biāo)志物進(jìn)行后續(xù)的臨床驗(yàn)證（圖3）。

圖3 MRM驗(yàn)證尿液外泌體蛋白

總結(jié)與討論

# 關(guān)于華盈 #

華盈生物還自主研發(fā)了Exosome Isolation Q3 系列外泌體提取試劑盒，可以針對(duì)尿液、血清/漿、細(xì)胞上清等樣本進(jìn)行外泌體的分離，得到的外泌體可以進(jìn)行下游的鑒定分析、RNA測(cè)序等。

多年來(lái)華盈生物服務(wù)客戶已經(jīng)覆蓋國(guó)內(nèi)各大著名的高校院所和多位院士課題組。華盈的專業(yè)和專注也已獲得業(yè)界普遍認(rèn)可，華盈生物外泌體研究合作伙伴的科研成果也先后在AdvﾠSci、JﾠClin Invest、Biomaterials、Cancer Res等著名期刊上發(fā)表。

參考文獻(xiàn)

1. Hiemstra TF, Charles PD, Gracia T, Hester SS, Gatto L, Al-Lamki R et al. Human urinary exosomes as innate immune effectors. J Am Soc Nephrol. 2014;25(9):2017-27.

2. Cheng J, Ji D, Yin Y, Wang S, Pan Q, Zhang Q et al. Proteomic profiling of urinary small extracellular vesicles in children with pneumonia: a pilot study. Pediatr Res. 2023. Online ahead of print.

3. Wang S, Kojima K, Mobley JA, West AB. Proteomic analysis of urinary extracellular vesicles reveal biomarkers for neurologic disease. EBioMedicine. 2019;45:351-361.