代謝組學助力發現Lip-SMap—繪制代謝物和蛋白相互作用圖譜的新方法
百趣代謝組學文獻分享，自2014年瑞士蘇黎世聯邦理工學院的Picotti和她的研究小組開始用Lip-SRM法測量復雜蛋白質混合物的大量結構改性蛋白質以來[1]；該研究小組隨后對方法進行改進，研究了復雜細胞基質中幾種生物蛋白質的熱穩定性，并推翻長期以來關于蛋白變性的定論，提出蛋白質變性全新理論[2]；該研究小組又以該技術為基礎發現細菌細胞中的蛋白和小分子代謝之間之前未知的相互作用。
生物體的各項生命活動以體內分子間的相互作用為基礎，如蛋白合成過程中，蛋白和DNA間、蛋白和蛋白間以及蛋白和RNA間的相互作用[3]；除此之外，小分子代謝物對于許多蛋白來說是非常重要的調節因子，在信號轉導、新陳代謝和蛋白翻譯過程中起著重要作用。但是，人們一直致力于研究蛋白與生物大分子間的相互作用，對蛋白質與小分子物質間相互作用的研究相對滯后。代謝組學文獻分享，隨著近幾年質譜儀、高通量蛋白組學和代謝組學的興起，一項涉及生物分子之間的相互作用的新組學-相互作用組學(interactomics)也進一步發展，這也預示著生物醫學研究和醫藥領域的改變[4]。
目前，對蛋白和代謝物間的相互作用主要基于一些特定類型(如催化)的相互作用或檢測小蛋白片段與代謝物間的相互作用，需要對代謝物進行化學修飾或選取某些特定類型的化合物。代謝組學文獻分享，因此，Paola Picotti課題組利用代謝物與蛋白結合會引起蛋白質結構改變的特點，開發了新的Limited (or native) proteolysis-small molecule mapping(LiP-SMap)法用于研究小分子代謝物和蛋白之間的相互作用，并開始在全蛋白組水平上系統地分析和定量了蛋白與代謝物間的相互作用，并建立了它們之間的關系。
2. 代謝組學文獻分享—LiP-SMap法技術路線與方法驗證
如圖1，與之前的Lip-SRM法[1,5]類似，首先在非變性的條件下提取蛋白質，然后將提取的蛋白分為兩組，一組加入小分子代謝物，讓其與蛋白質相互作用，另一組不進行任何處理；再加入廣譜的蛋白酶K(PK)產生結構特異性蛋白片段；得到的特異片段再經序列特異性的Trypsin酶解，最后用LC-MS法定量得到的肽段。代謝組學文獻分享，由于代謝物與蛋白的特異性結合會引起蛋白結構的局部改變，從而改變蛋白質被PK酶切的表位產生不同的肽組，通過與對照組的比較篩選出代謝物與蛋白的作用圖譜，從而找出結合位點。
圖1 LiP-SMap法技術路線(A:蛋白提取與酶解; B:肽段序列; C:MS檢測的肽段信號)
為驗證該技術的可靠性，選取有已知蛋白與代謝物作用位點的腺苷三磷酸(ATP)、苯丙氨酸(L-Phe)和磷酸烯醇式苯酮酸(PEP)3個物質進行研究，并加入E.coli的蛋白提取液中；代謝組學文獻分享，還用該方法篩選酵母細胞中與淺藍菌素結合的位點Fas2進行實驗。
3. 代謝組學文獻分享—大腸桿菌中的代謝物-蛋白質
互作網絡和結合位點分析
選擇E.coli作為研究對象，分別使用20種(圖2A,8個中心碳代謝相關代謝物，4個氨基酸，7個核苷磷酸和1個環腺苷單磷酸)不同的代謝中間產物檢測其與大腸桿菌蛋白的相互作用。代謝組學文獻分享，通過實驗，共檢測到1,678個代謝物-蛋白質的相互作用，其中1,447個未被報道過(圖2B)。進一步研究發現很多新相互作用與有機酸和糖磷酸鹽相關。
此外，將檢測到的代謝物-蛋白作用和BRENDA數據庫對比，發現該檢測方法的假陽性率不超過5.5%(有些新發現的作用由于未在數據庫中，也被認為是假陽性結果)。代謝組學文獻分享，為評估相互作用結果的可信度，該團隊也開發了STAR法對相互作用進行打分(圖2C)。
該團隊通過測定Protein Data Bank Ligand Expo數據庫中收集的代謝物蛋白復合物的結構，提供了基于高通量蛋白組水平的代謝物結合位點的譜圖信息(圖2D)。
圖2.代謝物與蛋白相互作用圖(A:中心碳代謝網絡圖; B:基于LiP-SMap檢測出的作用位點; C:1,678個LiP-SMap相互作用位點的得分分布; D：以GTP為代表的結合位點結構)
4. 代謝組學文獻分享—代謝物和蛋白相互作用特征與新調節方式發現
通過分析代謝物敏感的蛋白與E.coli的“核心蛋白組”之間的關系發現，代謝物更傾向于與濃度隨時間的變化較小或保持不變的蛋白結合(圖3A)。代謝組學文獻分享，這也可能預示在細胞調節蛋白質活性過程中，代謝物-蛋白的結合與蛋白濃度的變化是兩條互補的途徑。
代謝物通過變構、催化或配體誘導等方式實現酶的活性調控，那么是不是還有新的作用方式呢？該團隊又選取幾個參與中心碳代謝的代謝物與酶(檸檬酸與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶Ppc，果糖-1,6-二磷酸FBP與磷酸烯醇式丙酮酸合酶調控蛋白PpsR, FBP與果糖-6-磷酸脫氫酶)的相互作用進行研究，發現代謝物通過間接的方式調控酶的變構從而調節酶的活性(圖3B,C)。
圖3 代謝物和蛋白相互作用特征(A, 左:至少有一個代謝物結合位點的蛋白的累積變異系數曲線; 右: 排除與ATP、GTP和Citr.結合位點的蛋白的累積變異系數曲線; 橙:改性蛋白, 黑:非改性蛋白)與新調節方式發現(B,C: PpsA活性測定)
5. 代謝組學文獻分享—代謝物與蛋白在催化位點的相互作用
為研究催化活性或競爭性抑制，該團隊首先分析了大腸桿菌蛋白晶體結構信息，發現活性位點中代謝物與異構肽段的距離為6.44埃(圖3A)，并將6.44埃認為是活性位點作用范圍，大于6.44埃的遠端位點可能是變構位點或其他催化位點(圖3B,C)。
接著，對1,665個異構肽段的分析，發現37%的肽段是與已知化合物結合的活性位點，其中有部分位點理論上能與催化中心形成氫鍵(圖3D)。代謝組學文獻分享，此外，也發現有多個代謝物結合位點的酶大都具有氧化脫氫酶活性或參與涉及磷酸轉移的反應(圖3E)。
此外，該團隊也通過實驗進一步證明，LiP-SMap法能用于鑒定新的酶-底物相互作用和競爭性抑制位點。
圖4 代謝物與蛋白質結合位點的分析(A: 酶-代謝物復合物結構活性位點中所有檢測到的肽段與變構肽段的最小距離分布; B and C: 活性位點分布; D: 活性位點和遠端位點分布; E: 代謝物與酶結合位點分布,綠色-結合位點已知)
6. 代謝組學文獻分享—代謝物結合對蛋白高級結構的影響和量化指標
之前的研究中已經有學者提出代謝物的結合可引起蛋白復合物或者聚合物的形成或解離，該團隊也選取162個蛋白-代謝物對進行分析，發現約68%的蛋白-代謝物對變得更加敏感，另外32%抗性增加；另外也發現并驗證了代謝物的結合除引起結構重排、形成同系復合物或者作為雜合物亞基單元外，也能引起已知蛋白復合物的組成發生改變。
最后根據ATP結合位點可以對于ATP的結構反應度進行區分的特點，研究組提出了代謝物結合的量化指標in-extract Kds(圖5)；in-extract值在1-10mM范圍內時，有83%蛋白-代謝物相互作用是新發現的；代謝組學文獻分享，同時發現了111個新低親和位點， in-extract平均值為3.23。這也再次證明LiP-SMap法可直接用于確定復雜生物樣本中代謝物結合位點的量化指標。
圖5 LiP-SMap法測定細胞中代謝物結合位點親和力
7. 代謝組學文獻分享—小結
本文利用新開發的LiP-SMap法，結合生物化學實驗、代謝組以及蛋白組方法創新性地研究了代謝物-蛋白間的相互作用，并驗證了該方法可用于新的變構和催化位點的發現；同時也揭示代謝物與蛋白的結合會引起蛋白高級結構的變化。
代謝組學文獻分享，該方法簡單高效，不需要特殊的化學反應或者添加保護基團，可用來測定藥物與細胞蛋白之間的相互作用并確定藥物的作用靶標，為制藥行業的研究提供了一種新的有效工具。
代謝組學文獻分享—參考文獻：
[1] Yuehan Feng, etal Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol.2014 Oct;32(10):1036-44.
[2] Leuenberger P , et al. Cell-wide analysis of Protein thermal unfolding reveals determinants of thermostability.Science.2017 Feb 24;355(6327).
[3] Tagore R, et al. A Global Metabolite Profiling Approach to Identify Protein-Metabolite Interactions. J Am Chem Soc.2008 Oct 29;130(43):14111-3.
[4] Guo H,Peng H,Emili A. Mass spectrometry methods to study protein-metabolite interactions. Expert Opin Drug Discov.2017 Dec;12(12):1271-1280.
[5] Schopper S, et al. Measuring protein structural changes on a proteome wide scale using limited proteolysis-coupled mass spectrometry. Nat Protoc.2017 Nov;12(11):2391-2410.
