應用：利用微波快速高效水解寵物食品中的氨基酸
介紹
蛋白質在濕寵物食品和干寵物食品的生產過程中起著重要作用。蛋白質的質量和數量不僅影響生產的總成本，還影響消費者對產品的興趣。評估膳食蛋白質質量的一種方法是通過氨基酸水解檢查樣品的總氨基酸含量。通常，蛋白質在酸性或堿性條件下水解24小時以上。這種處理打破了蛋白質中氨基酸殘基之間的肽鍵，最終實現了每個氨基酸的鑒定和定量。由于常規加熱的特點是緩慢的體積加熱、不穩定的熱梯度和不一致的反應產率，因此需要較長的反應時間。
微波輔助反應已被強調為一種顯著縮短水解時間、提高反應產率和重現性的方法。1,2 CEM的Discover®2.0微波反應器為優化蛋白質水解反應提供了一條極好的途徑。在此，對濕和干寵物食品進行傳統的酸水解以及優化的微波輔助水解條件。使用Waters AccQ Tag™ 超衍生試劑盒，通過柱前衍生法測定每個樣品的氨基酸含量，然后在260nm下進行LC-PDA分析。總的來說，Discover 2.0的結果較優于傳統水解，且具有關鍵的優點，包括更短的反應時間、更清潔的水解產物和更快的分析時間。
材料和方法
試劑和樣品
化學品從商業供應商處購買，未經進一步純化即可使用。用于傳統和微波輔助氨基酸水解的溶液在使用前新鮮制備。所有玻璃器皿在110°C的空氣烘箱中干燥4小時。所有寵物食品樣品均化并儲存在陰涼干燥的地方（對于干樣品）或4ºC（對于濕樣品），直到分析。使用分析天平將每個樣品的40至50mg部分稱重到其反應容器中。使用Waters AccQ Tag Ultra Derivation試劑盒分析所有樣品，用于260nm下的LC-PDA分析。
傳統酸水解法
將寵物食品樣品加入清潔干燥的10 mL玻璃瓶中，然后加入2mL 6 N HCl。然后用N2吹掃小瓶，快速密封，然后放入110°C 空氣烘箱中24小時。將樣品水解物冷卻至室溫，然后通過0.2 µm PTFE過濾器。然后用6M NaOH中和無顆粒樣品，以準備AccQ Tag衍生化。
Discover 2.0 水解方法
水解反應制備：將各樣品的50 mg部分添加到配備有微攪拌棒的35mL Pyrex容器中。用移液管將5mL體積的含1%苯酚（w/v）的6N HCl移到每個容器中。用N2流吹掃容器5分鐘，用Tefon內襯硅帽快速密封，并放置在自動取樣器架中，以便自動放置到Discover 2.0腔中。反應完成后，將冷卻的樣品中和并過濾，以準備AccQ Tag™ 衍生化。
方法編程：在Discover 2.0系統中編程一步動態法，用于寵物食品樣品的氨基酸水解。
酸水解
容器類型：Pyrex
控制類型：動態
溫度：160°C
時間：30分鐘
壓力：300 PSI
功率：300 W
攪拌：高
分析樣品制備
對于AccQ Tag衍生化，將來自Waters AccQ Tag-Ultra衍生化試劑盒的70µL硼酸鹽緩沖液添加到完整的回收小瓶中，然后添加10µL過濾和中和的樣品。將小瓶蓋上并使用旋渦混合器混合。此外，將20µL從Waters試劑盒制備的衍生化試劑添加到每個樣品反應中，移液管尖端直接置于反應溶液中。在分析之前，將總反應渦旋10秒，然后在55℃下加熱10分鐘。
分析
將4µL每種衍生反應注入ACQUITY™上變頻器™ 系統，連接到Waters PDA探測器。在Waters AccQ Tag Ultra C18柱（1.7µm，2.1 x 100 mm）上以0.4 mL/min的流速進行分離。柱溫為55℃。洗脫梯度如表1所示。流動相為A:Waters AccQ Tag洗脫液A，在MilliQ水中稀釋10倍，B:Waters-AccQ Tag-Eluent B。為了測定每種氨基酸的氨基酸濃度，將Waters氨基酸標準品（Waters Corporation，零件號WAT088122）衍生為以下濃度：1、5、10、25、50和100 pmol/µL，并且所得到的線性曲線被強制通過零。所有分析均使用Waters TargetLynx軟件™進行。
表1. 用于衍生氨基酸分離的梯度
結果和討論
使用CEM的Discover 2.0微波反應系統對干狗（貓）糧和濕寵物食品樣品進行微波輔助氨基酸水解。每種水解產物的氨基酸含量通過柱前衍生化測定，隨后通過配備PDA檢測器的LC分析測定，PDA檢測器設置為在260nm下監測。將結果與從相同樣品的傳統烘箱水解反應獲得的結果進行比較。傳統的結果被認為是100%的回收率。表2描述了每個氨基酸殘基與其傳統水解對應物的回收率。對于干和濕寵物食品樣品，所有回收率均在可接受的回收率范圍內，即60至130%。此外，與傳統水解反應相比，微波輔助反應的標準偏差更高（如圖1所示）。
與傳統水解反應相比，微波輔助反應在標準偏差方面表現出更高的精度（如圖1所示）。
Discover 2.0與傳統氨基酸水解協議相比具有多種優勢。添加磁攪拌有助于樣品的均勻性，而壓縮空氣冷卻使反應容器在幾分鐘內達到安全的處理溫度。Discover 2.0的微波加熱機制提供了與傳統加熱相當的結果，在30分鐘內提高了精度，從而縮短了分析時間，并為反應優化提供了更大的機會。該方法還代表了用于酸和堿氨基酸水解反應的安全和自動化平臺。
表2. 干濕寵物食品中氨基酸的回收率——微波輔助與傳統氨基酸水解
圖1. 濕寵物食品的氨基酸水解結果
結論
這項研究強調了CEM的Discover 2.0是一種有效的方法，可用于濕寵物食品和干寵物食品的氨基酸水解。總的來說，Discover 2.0的結果在準確性和精密度方面較優于傳統的烘箱水解結果，主要優點是反應時間更短、水解產物更清潔、分析時間更快。
參考文獻
1 Chen, S. T.; Chiou, S. H.; Chu, Y. H.; Wang, K. T. Int. J. Pept. Protein Res. 1987, 30, 572-576.
2 Margolis, S. A.; Jassie, L.; Kingston, H. M. J. Automat. Chem. 1991, 13, 93-95.
AccQ-Tag™, ACQUITY™ UPLC™ , and TargetLynx™ are trademarks of Waters Corporation.
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