科技前沿丨電致化學發光成像
 

本文作者：趙微 博士

電致化學發光（electrogenerated chemiluminescence，ECL），又稱電化學發光，源于電化學反應電子傳遞過程中將電能轉化為輻射能的過程。發光分子在電極表面經過氧化還原過程生成激發態，進而退激產生發光。

針對電致化學發光的詳細研究始于二十世紀六十年代，隨著電子技術以及高靈敏的光電傳感器如光電倍增管、單光子計數器的出現，電致化學發光傳感得到了迅猛發展。
近年來，結合光學顯微鏡與電子倍增圖像傳感器（EMCCD）的電化學發光顯微鏡（ECLM）獲得了極大的關注，成為電化學測量中一種創新性的技術手段。

電化學發光成像具有低背景、無光熱效應、高通量、高時間分辨率、可控性好等優點，為研究微納界面電化學反應過程提供了極具發展潛力的技術手段。這種成像技術在能源、材料及生命分析領域，具有卓越的應用前景。

 

    1. 電致化學發光原理    

電致化學發光是一種在電極表面通過電化學引發的特異性化學發光反應^[1]。在外加電激勵下，電極表面首先發生電化學反應并產生化學發光所需的活性中間體，隨后中間體之間或者中間體與共反應劑提供的高能自由基之間相互作用，形成激發態物種，進一步退激產生發光。根據發光機理的不同，ECL現象被分為“湮滅型”和“共反應劑型”兩種途徑^[2]。

1.1 湮滅型ECL

如圖1所示，在湮滅型 ECL 中，通過施加雙向電刺激，反應體系內分別產生發光物種的氧化態和還原態中間體，兩種中間體反應生成高能激發態分子，進一步退激至基態產生發光。
 

1.2 共反應劑型ECL

相較于湮滅型ECL，共反應劑型ECL通常具有更高的發光效率，因此電致化學發光發光成像通常基于此種模式。

共反應劑型ECL只需施加單向電位。該體系中的共反應劑提供了高能自由基，這些自由基能夠與發光體反應，從而達到激發態。共反應劑ECL的機制包括“氧化還原”和“還原氧化”兩種路徑。以“氧化還原”ECL為例（圖2A），其反應過程通常遵循三個步驟：

（1）電極表面的氧化反應；

（2）共反應劑（如三正丙胺（TPrA））生成強還原自由基；

（3）共反應劑自由基使氧化的發光中間體還原，產生激發態物種。

相應的，在“還原氧化”路徑中（圖2B），共反應劑（如S2O82-）產生強氧化自由基，該自由基進一步與還原態發光物種反應生成激發態。
 

圖2. “氧化還原”（A）和“還原氧化”（B）共反應劑型ECL機制

 

    2. 電致化學發光裝置    

ECLM成像裝置的核心部件包括電化學反應池、電化學工作站、正置或倒置顯微鏡、以及CCD或EMCCD（圖3）。為提高圖像分辨率，通常會選用高數值孔徑（N.A.）的物鏡。

此外，信號發生器可作為輔助裝置，對電觸發與光采集進行同步。在成像操作中，關閉外部光源后，利用電位階躍或循環伏安法觸發電化學反應，同步采用CCD或EMCCD實時捕獲ECL圖像。
 

圖3. ECL 顯微成像系統的示意圖及典型裝置

    3. 電致化學發光成像進展    

從上世紀80年代至今，電致化學發光成像經歷了蓬勃的發展。

1987年，Engstrom等報導了采用ECL成像直接觀測電極的邊緣效應。由于電極邊緣的非線性擴散，在圓盤電極邊緣處成像出非均勻的電流密度^[3]。同年，該課題組報導了異質結構電極表面電化學活性的ECL直接成像^[4]。這是ECL成像首次應用于電極電化學性能的表征。

1999年，Wightman課題組報導了在不同脈沖頻率下，電極表面ECL成像非均勻電流密度。通過調節脈沖寬度，在高曲率的位置可獲得更大的電流密度和可控的ECL光源^[5]。近年來，隨著成像設備的提升，ECL成像可深入單分子、單顆粒和單細胞層面，并獲得微納界面動態信息。

2008年，Bard課題組在有機相中成像出單個25nm共軛聚合物納米粒子電子轉移過程中的動態信息，開啟了單體電致化學發光成像的先河^[6]。法國波爾多大學Sojic課題組多年來一直致力于ECL成像與測量研究，他們報導了一種基于單個微米球的ECL反應活性成像技術。這種3D成像方法提供了一種全新的模式用于ECL反應機理研究及共反應劑效能表征，對于篩選共反應劑，提高分析靈敏度等方面都有著重要意義^[7]。

2018年，徐靜娟教授團隊在60 nm單顆粒微納界面上開展電子傳遞和物質遷移等過程的ECL成像。通過對異質金屬雙面神（金-鉑結構）界面電化學反應的實時成像，測得異質結構納米材料具有更高的催化轉化效率及穩定性^[8]。

2020年，浙江大學蘇彬教授報道了基于單晶分子線的電致化學發光波導，系統地研究了在電化學激發下，單個Ir(piq)3分子線的波導行為^[9]。
 

圖4：基于單晶分子線的波導電致化學發光
 

在單細胞動態分析方面，表面限域ECL成像^[10]、免標記ECL成像^[11]、局部電勢調控的高靈敏ECL成像^[12]等也為精準理解生命過程中的化學基礎提供了先進的測量技術。然而，作為一種光學成像技術，ECLM受到衍射極限的影響，無法得到更精細的結構信息。因此，發展超分辨電致化學發光顯微鏡（Super-resolution ECLM）打破傳統衍射極限，對于單體層面、微納界面分析成像具有重要意義。

2021年，浙江大學馮建東研究員課題組在Nature發表了研究論文，發展了一種單分子ECL成像技術，對ECL中單個分子發射的單個光子的位置進行成像^[13]，并使用極稀釋的溶液來確保這些分子在空間上分開。該技術用于空間高斯擬合后可以打破光學衍射極限，使其成像分辨率媲美超分辨率熒光顯微鏡。
 

圖5：活體細胞的單分子ECL成像

 

上海大學趙微教授與南京大學徐靜娟教授聯合在JACS報道了基于發光徑向漲落的超分辨成像（SRRF）的超分辨ECLM^[14]。通過連續采集寬場ECL圖像，并求解ECL信號漲落的徑向梯度變化實現超分辨成像。這種算法通過梯度收斂性逼近發光中心的真實位置，不需要特殊樣品及復雜裝置，且不需要數千幀的累計，在提高空間分辨率的同時，保持較高的時間分辨率，適用于動態過程成像。

圖6：單顆粒ECL-SRRF成像示意圖

 

電致化學發光成像歷經數十年發展，機遇與挑戰并存。設計并合成高量子產率的發光試劑，降低成像背景提高測量靈敏度，以及進一步提升成像的空間與時間分辨率，是科研人員奮進的方向。毫無疑問，這種成像技術的進步會極大地推動其在應用領域的發展，并幫助人們更多的了解科學和自然的本質。

作為光學技術的先進制造商，Evident秉承Olympus持續推動最前沿科學技術進步的承諾，為電化學發光成像研究提供優秀的顯微成像設備，尤其是數值孔徑高達1.5和1.7的超高分辨物鏡，特別適合單分子或者單顆粒電化學發光的弱信號檢測。

從左到右：UPLXAPO40XO，數值孔徑1.4

UPLAPO60XOHR，數值孔徑1.5

UPLAPO100XOHR，數值孔徑1.5

APON100XHOTIRF，數值孔徑1.7
 

針對電化學發光成像原理及易受環境光干擾等應用特點，我們推出了IXplore Live for Luminescence — 單細胞發光成像解決方案（點擊查看詳情）。該系統采用簡約箱體式設計，高效避光，配合EMCCD高靈敏檢測器，輕松實現高信噪比、高分辨率的發光成像。高穩定性成像系統配合高適應性實驗設計，滿足各種樣品及應用需求。
 

參考文獻
1.  Guo, W.; Zhou, P.; Sun, L.; Ding, H.; Su, B. Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 2089-2093.
2.  Zhao, W.; Chen, H. Y.; Xu, J. J. Chem. Sci. 2021, 12, 5720-5736.
3.  Engstrom, R. C.; Pharr, C. M.; Koppang, M. D. J. Electroanal. Chem., 1987, 221, 251.
4.  Engstrom, R. C.; Johnson, K.W.; DesJarlais, S. Anal. Chem., 1987, 59, 670.
5.  Russell, G. M.; McDonald, E. M.; Wightman, R. M. Anal. Chem. 1999, 71, 4944.
6.  Chang, Y.-L.; Palacios, R. E.; Fan, F.-R. F.; Bard, A. J.; Barbara, P. F. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 8906–8907.
7.   Sentic, M.; Milutinovic, M.; Kanoufi, F.; Manojlovic, D.; Arbault, S.; Sojic, N. Chem. Sci. 2014, 5, 2568–2572.
8.   Zhu, M. J.; Pan, J. B.; Wu, Z. Q.; Gao, X. Y.; Zhao, W.; Xia, X. H.; Xu, J. J.; Chen, H. Y. Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 4010 –4014.
9.   Guo, W.; Ding, H.; Zhou, P.; Wang, Y.; Su, B. Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 6745–6749.
10. Voci, S.; Goudeau, B.; Valenti, G.; Lesch, A.; Jović, M.; Rapino, S.; Paolucci, F.; Arbault, S.; Sojic, N. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 14753−14760.
11. Ma, C.; Wu, S.; Zhou, Y.; Wei, H.-F.; Zhang, J.; Chen, Z.; Zhu, J.-J.; Lin, Y.; Zhu, W. Angew. Chem., Int. Ed. 2021, 60, 4907−4914.
12. Zhang, J. J.; Jin, R.; Jiang, D. C.; Chen, H. Y. J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 10294–10299.
13. Dong, J.; Lu, Y.; Xu, Y.; Chen, F.; Yang, J.; Chen, Y.; Feng, J. Nature 2021, 596, 244−249.
14.Chen, M. M.; Xu, C. H.; Zhao, W.; Chen, H. Y.; Xu, J. J. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 18511−18518.