近年來，紅外光譜和顯微成像技術有了突飛猛進的發(fā)展,尤其是在生命科學領域，得益于紅外光譜技術對于分子結構的敏感性，其能夠在無任何標記的情況下實現(xiàn)對生物樣品成分的鑒定和分布解析，這對于不便于熒光標記的一些生物樣品鑒別十分有利。然而目前大多數的紅外光譜空間分辨率受限于紅外光的衍射極限，只有10-20 μm，且依賴于紅外光波波長。另外多數紅外檢測設備對于生物樣品制樣過程也有著嚴格要求，如樣品切片厚度，細胞和組織尺寸，含水量，需要熒光染色等，這對于生命科學研究非常不利。

    針對上述問題，美國Photothermal Spectroscopy Corp公司經多年潛心攻關，研發(fā)出非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)—mIRage，該設備憑借其獨有的光學光熱紅外（O-PTIR, Optical Photothermal Infrared）技術克服了上述問題，將紅外光譜的空間分辨率提升至亞微米（~500 nm）；無需制備薄片，直接測試較厚樣品，極大地簡化了制樣過程、提高測試效率；同時可實現(xiàn)無接觸式地快速簡易測量，有效避免了傳統(tǒng)ATR模式下的散射像差和交叉污染。且該設備在反射模式下所得譜圖與透射模式下FTIR完全一致，還可以選配透射模式，十分適用于液體樣品和一些特殊混合樣品，極大的擴展了光熱紅外在生命科學領域的應用范圍(如圖1所示)。這項先進技術讓mIRage有別于傳統(tǒng)的紅外測試設備，能夠對生命科學領域的常用樣本，諸如細胞爬片，病理組織切片，單細胞細菌等有良好的兼容性，并讓活細胞觀測成為可能。除此之外，mIRage還可與拉曼光譜進行聯(lián)用，實現(xiàn)同時同地相同分辨率的IR和Raman測試，且無熒光風險，能夠幫助研究者更快速全面的確定所分析生物樣品的化學組成信息。

圖1. O-PTIR光學光熱紅外顯微鏡，工作原理及鈣化乳腺組織的O-PTIR紅外成像圖

光學光熱紅外O-PTIR在生命科學領域應用的顯著優(yōu)勢：

1.亞微米級的空間分辨率；

2.可直接獲取液體中活細胞的紅外成像；

3.靈敏度高，可直接觀測單細胞 (如細菌、哺乳動物細胞等)；

4.無米氏散射干擾，即使在細胞邊緣也不受影響；

5.高的光譜分辨率；

6.無需直接接觸即可測量軟組織的紅外光譜；

7.可實現(xiàn)紅外和拉曼同步測量；

8.可實現(xiàn)超過10 μm厚的樣品測試，直接置于載玻片上觀察分析；

9.可配置極化的紅外光源；

典型案例分析：

1.感染瘧原蟲的紅細胞表征

    瘧原蟲屬寄生蟲引起的瘧疾是威脅生命的主要疾病之一，而瘧原蟲引發(fā)的感染周期十分復雜，因此在細胞和分子水平觀察瘧原蟲的變化對于研究瘧原蟲的致病有著重要意義。Agnieszka M. Banas等人通過使用O-PTIR對瘧原蟲感染的紅細胞在亞微米尺度的分子特征變化進行了表征，結果顯示正常紅細胞的蛋白呈現(xiàn)環(huán)狀分布，而感染后的紅細胞蛋白質則呈現(xiàn)無規(guī)則分布。通過對比傳統(tǒng)FTIR與基于O-PTIR技術能夠發(fā)現(xiàn)，O-PTIR能夠提供更為詳細的圖像分辨率并且能夠測量紅細胞不同位置的光譜信息。而傳統(tǒng)FTIR受制于米氏散射限制，效果較差。

圖2. 對比FTIR與O-PTIR對紅細胞成像的結果：(a)紅細胞的白光圖；(b)圖a中紅色方塊放大的區(qū)域；(c,e)FTIR的蛋白/脂質空間分布的紅外成像；(d,f)O-PTIR的蛋白/脂質空間分布的紅外成像；(g)紅細胞的FTIR紅外光譜；(h)紅細胞的O-PTIR紅外光譜;(g,i)瘧原蟲感染紅細胞和正常紅細胞的PCA（PC1&PC2，PC1&PC3）得分；(h,j)瘧原蟲感染紅細胞和正常紅細胞的PCA（PC1&PC2，PC1&PC3）得分

參考文獻：

B. [Malaria] “Comparing infrared spectroscopic methods for the characterization of Plasmodium falciparum-infected human erythrocytes” (Nature Communication Chemistry, https://doi.org/10.1038/s42004-021-00567-2). Advantages: 1, 3, 4, 5, 6

2.單個病毒的紅外成像

    受制于紅外極限分辨率的限制，單個病毒的紅外光譜成像一直以來都是十分困難的，對于只有100 nm左右的病毒進行紅外光譜成像顯得十分無力。Yi Zhang等人使用O-PTIR技術成功實現(xiàn)對單個痘病毒進行了檢測，并成功觀測到了病毒的外形，并對病毒表面的蛋白的光譜進行了表征。

圖3.單個痘病毒的光譜和成像表征。(a)痘病毒的干涉散射圖像;(b)痘病毒1550cm^-1波束下的MIP圖像;(c)痘病毒1650cm^-1波束下的MIP圖像;(d)隨機選取病毒上4個點的光譜

參考文獻：

“Vibrational Spectroscopic Detection of a Single Virus by Mid-Infrared Photothermal Microscopy” (Analytical Chemistry, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05333). Advantages: 1, 3, 4, 5, 6

3. 光學光熱紅外O-PTIR與Raman光譜協(xié)同分析固定或活的單細胞

    英國曼徹斯特大學的Peter Gardner教授近期發(fā)表了他們關于活(和固定)細胞振動光譜分析的最新研究結果。作者使用光學光熱紅外O-PTIR與Raman光譜，并借助于兩個激發(fā)源（QCL和OPO激光器），對細胞進行了寬光譜范圍的覆蓋，從而使所有與生物學相關的分子振動都能被檢測到，且保持一致的亞微米的空間分辨率。此外，紅外光譜采集與拉曼光譜有效的結合起來，在相同的激發(fā)位置，形成振動互補，得到一套完整的振動光譜信息。如下圖所示，該紅外和拉曼的組合方式可以用來分析液體環(huán)境中固定或活細胞的亞細胞結構，其中的蛋白質二次結構及富脂體均可以在亞微米尺度上被有效地識別出來。

圖4. O-PTIR觀測固定未染色MIA PaCa-2細胞成像。(a)固定的未染色的MIA PaCa-2細胞的光學圖像；(b)紅色方塊區(qū)域的放大圖像；(c)OPO波束段的O-PTIR紅外光譜；(d)QCL波束段O-PTIR的紅外光譜；(e)黑色區(qū)域的拉曼和紅外光譜

參考文獻

D. [Mammalian cancer cell] “Analysis of Fixed and Live Single Cells Using Optical Photothermal Infrared with Concomitant Raman Spectroscopy” (Analytical Chemistry, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c04846). Advantages: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7

4. O-PTIR與S-XRF聯(lián)用探究阿爾茲海默癥

    阿爾茲海默癥是老年癡呆癥最常見的病因之一，而淀粉樣β蛋白沉淀是引發(fā)AD的重要病因之一，因此對于淀粉樣β蛋白分布的研究就顯得十分重要。Nadja Gustavsson等人通過O-PTIR成功觀測到了神經中的淀粉樣β蛋白分布，并且結合S-XRF分析發(fā)現(xiàn)鐵簇與淀粉樣β-折疊結構和氧化的脂質存在共定位關系。這項研究充分預示了O-PTIR/S-XRF聯(lián)合技術可在AD疾病的研究中發(fā)揮重要作用。

圖5.單個神經元的O-PTIR與X光熒光成像。（a）單個神經元的光學（左）與O-PTIR圖像（中和右）（b）神經元上銅、鐵的分布（c）鐵與蛋白疊合圖（d）鐵與脂質的疊合圖

參考文獻

[Neuron] “Correlative optical photothermal infrared and X-ray fluorescence for chemical imaging of trace elements and relevant molecular structures directly in neurons”  (“Light: Science & Applications” https://doi.org/10.1038/s41377-021-00590-x) Advantages:   1, 3, 4, 5, 6

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1、非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)—mIRage
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