文章標(biāo)題：Metabolomics analysis of cucumber fruit in response to foliar fertilizer and  pesticides using UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS
發(fā)表期刊：Food Chemistry
發(fā)表時(shí)間：2021年8月
影響因子：7.514
合作客戶：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
百趣生物提供服務(wù)：非靶標(biāo)代謝組學(xué)

研究背景
黃瓜(Cucumis sativus L.)被認(rèn)為是最健康的蔬菜之一，因?yàn)樗鼮槿梭w提供各種營(yíng)養(yǎng)，如葫蘆素、木脂素和黃酮類化合物。黃瓜產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)效益好，在我國(guó)大棚中廣泛種植。由于溫室栽培黃瓜具有高溫、高濕、通風(fēng)不良、土壤更新困難等特點(diǎn)，而黃瓜根系本身對(duì)土壤環(huán)境敏感，導(dǎo)致溫室栽培黃瓜面臨蟲害、營(yíng)養(yǎng)不良等諸多問題，農(nóng)藥和化肥常用于提高黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)。

但由于代謝物的高度復(fù)雜性和設(shè)備的限制，研究這種混合施用對(duì)黃瓜代謝的影響受到限制。

本文采用配備有加熱電噴霧電離（HESI）源的超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜分析黃瓜果實(shí)中的代謝物譜。結(jié)合代謝組學(xué)和表型研究結(jié)果，建立了生化網(wǎng)絡(luò)，為黃瓜果實(shí)在農(nóng)藥和葉面肥混合使用下的代謝途徑提供了機(jī)制分析。

結(jié)果和討論
1.黃瓜果實(shí)有機(jī)酸的針對(duì)性分析
有機(jī)酸是水果和蔬菜中的天然化合物。作為水果風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要組成部分，水果中有機(jī)酸的含量和種類是決定水果品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。在試驗(yàn)過程中，分析了不同處理對(duì)黃瓜果實(shí)有機(jī)酸的影響。由圖1 (a-e)可以看出，不同處理，特別是T3處理(吡蚜酮、戊唑醇和葉面肥)黃瓜果實(shí)中有機(jī)酸含量均高于CK處理，在7d時(shí)差異達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

酒石酸是黃瓜果實(shí)中所含的一種獨(dú)特成分，具有抑制人體糖向脂肪轉(zhuǎn)化的作用，被認(rèn)為是一種天然的減肥食品。抗壞血酸(AsA)(維生素C)是一種眾所周知的抗氧化劑，具有解毒、抗癌和清除自由基的作用。葉面肥配合農(nóng)藥的施用可顯著提高黃瓜果實(shí)中酒石酸和AsA的含量,表明混合使用肥料和殺蟲劑不能僅僅提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,也更好地抑制糖轉(zhuǎn)換成脂肪在人體內(nèi)。

2.黃瓜果實(shí)抗氧化能力的針對(duì)分析
GST、POD、AsA、GSH在植物的解毒過程中發(fā)揮重要作用。圖1 (e-h)顯示，在0.17 d時(shí)，不同處理對(duì)植物的抗氧化能力有較大影響在0.17 d時(shí)，結(jié)果表明黃瓜果實(shí)能快速激活抗氧化系統(tǒng)以緩解外界脅迫。黃瓜果實(shí)抗氧化能力受農(nóng)藥(T1和T2)的影響而增強(qiáng)，在葉面肥中添加農(nóng)藥(T3)進(jìn)一步增強(qiáng)，這與農(nóng)藥快速消散一致。

在農(nóng)藥(毒死蜱、樂果、狄氏劑)與肥料的混合使用中，抗氧化酶得到了增強(qiáng)，因?yàn)榉柿现械奈⒘吭�素提高了抗氧化酶的濃度，減少了農(nóng)藥造成的抗氧化損傷。因此葉面肥和農(nóng)藥的混合施用可顯著提高黃瓜果實(shí)的抗氧化活性，有利于促進(jìn)農(nóng)藥的消散。
 

3.不同處理對(duì)黃瓜果實(shí)整體代謝譜的影響
利用UHPLC/ESI-Q-Orbitrap HRMS代謝組學(xué)方法獲得黃瓜果實(shí)的代謝產(chǎn)物譜。
從圖2的火山圖可以看出，與其他處理相比，T3處理的樣品大部分都是上調(diào)的。與T2相比，T3處理下上調(diào)化合物在總差異化合物中所占比例接近100%，說明葉面肥的添加對(duì)農(nóng)藥脅迫下黃瓜果實(shí)的代謝具有顯著影響。與T1相比，T2處理下下調(diào)的化合物在總差異化合物中所占比例接近100%，說明聯(lián)合施用農(nóng)藥和單獨(dú)施用農(nóng)藥顯著改變了黃瓜果實(shí)代謝。
 

圖2.不同組別的差異代謝物火山圖
 

圖3-1.黃瓜果實(shí)代謝譜數(shù)據(jù)的PCA評(píng)分圖 T1:單獨(dú)使用吡蚜酮；T2:吡蚜酮與戊唑醇合用；T3:吡蚜酮與戊唑醇、葉面肥配合使用；QC:質(zhì)量控制。



圖3-2.不同處理的OPLS-DA評(píng)分圖 T1:單獨(dú)使用吡蚜酮；T2:吡蚜酮與戊唑醇合用；T3:吡蚜酮與戊唑醇、葉面肥配合使用。

注：圖3-1和圖3-2Pca和oplsda結(jié)果表明組間區(qū)分效果非常好。
 

4.綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示不同處理下黃瓜果實(shí)的代謝反應(yīng)
（1）不同處理對(duì)黃瓜果實(shí)代謝途徑的響應(yīng)
生理變化是代謝變化的結(jié)果，代謝物豐度的變化反映了特定代謝途徑的抑制或激活，這也代表了代謝重排。將所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果整合到MetaboAnalyst分析生物通路。結(jié)果表明，鑒定的化合物涉及36個(gè)代謝途徑。本研究共構(gòu)建了12條代謝途徑，包括氨酰- trna生物合成途徑；酪氨酸代謝；三羧酸循環(huán)；精氨酸和脯氨酸代謝；異喹啉生物堿生物合成；甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝；苯丙氨酸代謝；半胱氨酸和蛋氨酸代謝；丙酮酸代謝；丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝；淀粉和蔗糖代謝；色氨酸代謝。
 

圖4.中樞代謝生物合成途徑的代謝產(chǎn)物網(wǎng)絡(luò)變化
 

圖4較為完整地展示了中樞代謝生物合成途徑的代謝產(chǎn)物網(wǎng)絡(luò)變化，包括糖酵解、TCA循環(huán)、氨基酸代謝和抗氧化系統(tǒng)代謝。雖然糖酵解相關(guān)的中間體沒有變化，但不同處理下的凈光合速率的增加表明糖酵解途徑被激活。此外，三羧酸循環(huán)中間體(檸檬酸和l -蘋果酸)的豐度上調(diào)，表明三羧酸循環(huán)發(fā)生了上調(diào)。糖酵解和三羧酸循環(huán)是能量相關(guān)的途徑。這兩個(gè)途徑的上調(diào)表明，混合農(nóng)藥處理后，黃瓜果實(shí)產(chǎn)生更多的能量，尤其是葉面肥處理。同時(shí)，脂肪酸含量顯著降低，說明糖酵解和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的能量沒有積累，而是被消耗以維持正常的生理過程和/或增加防御相關(guān)活動(dòng)。

（2）不同處理對(duì)黃瓜果實(shí)氨基酸代謝的影響
不同處理下氨基酸含量的變化表明了黃瓜果實(shí)氮素代謝的重塑(圖5)。在本研究中，與兩種農(nóng)藥（T2）的混合使用相比，添加氨基酸葉面肥（T3）實(shí)際上降低了5天時(shí)的氨基酸含量，表明葉面肥和農(nóng)藥的混合使用可能會(huì)改變黃瓜果實(shí)中低分子量氮源的組成。然而，由于這個(gè)實(shí)驗(yàn)只涉及黃瓜果實(shí)中的氨基酸的變化在5天，和氨基酸在黃瓜果實(shí)不斷合成和代謝，有必要對(duì)氨基酸進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步研究了黃瓜果實(shí)中氨基酸轉(zhuǎn)換的潛在機(jī)制。
 

圖5.不同處理黃瓜果實(shí)中氨基酸的相對(duì)豐度

除絲氨酸外，其余脂肪氨基酸(纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸和谷氨酰胺)均有相同的響應(yīng)趨勢(shì)：T1處理黃瓜果實(shí)中上述氨基酸含量普遍高于對(duì)照，T2處理和T3處理均降低了上述氨基酸含量。結(jié)果表明，吡蚜酮單獨(dú)施用和吡蚜酮與戊唑醇混合施用對(duì)黃瓜果實(shí)中部分脂肪族氨基酸含量的影響完全不同。

不同處理黃瓜果實(shí)中絲氨酸、色氨酸、組氨酸和脯氨酸含量均低于對(duì)照。生理結(jié)果表明，不同處理對(duì)植物生長(zhǎng)有積極作用，即增加有機(jī)酸含量，促進(jìn)光合作用。然而，不同處理對(duì)生長(zhǎng)素生物合成的重要前體色氨酸含量沒有顯著影響。以往的研究報(bào)道，脯氨酸在許多植物中都是在環(huán)境脅迫下積累的，而脯氨酸的上調(diào)可以消除活性氧(ROS)，抑制脂質(zhì)過氧化，有助于植物適應(yīng)各種環(huán)境脅迫。這與本試驗(yàn)中脯氨酸含量的降低不一致。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，菌根植物的脯氨酸濃度低于非菌根植物，這可能是由于菌根植物的耐鹽性更高，以及其他耐鹽機(jī)制的增強(qiáng)。

本試驗(yàn)中，黃瓜果實(shí)脯氨酸含量在5d時(shí)的降低可能與其他相關(guān)抗氧化能力的提高有關(guān)。此外，還與農(nóng)藥脅迫的減少有關(guān)，即農(nóng)藥造成的危害減少。芳香族氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)參與莽草-苯丙氨酸途徑。與對(duì)照相比，T1和T2處理中芳香氨基酸含量增加，T3處理降低。莽草酸-苯基丙酸途徑可產(chǎn)生多種抗氧化劑(如類黃酮和酚類)及其前體(如芳香族氨基酸)，以清除或抑制農(nóng)藥脅迫下植物細(xì)胞中ROS（活性氧）的合成。

結(jié)論
采用非靶向代謝組學(xué)和生理分析方法，研究了吡蚜酮、戊唑醇和葉面肥對(duì)黃瓜植株生長(zhǎng)和果實(shí)代謝的影響。結(jié)果表明與單獨(dú)施用農(nóng)藥或兩種農(nóng)藥混合施用相比，葉面肥與農(nóng)藥混合施用可提高葉綠素和氮含量，促進(jìn)植物光合作用，從而調(diào)節(jié)黃瓜果實(shí)中相關(guān)代謝產(chǎn)物和代謝途徑，提高了黃瓜果實(shí)的品質(zhì)和抗氧化能力，促進(jìn)了農(nóng)藥的消散。因此，葉面肥與農(nóng)藥的混合施用是提高黃瓜果實(shí)品質(zhì)、促進(jìn)農(nóng)藥在果實(shí)中消散的有效策略。