RNA 逆轉錄實驗注意事項
Tips 1：防止 RNA 模板的降解
毫無疑問，RNA 質量對 cDNA 合成結果會產生重要影響。但 RNA 很脆弱，易于降解。為了保證 RNA 的完整性，我們需要小心又小心，比如在冰上操作，用 RNase-free 的槍頭和離心管，減少操作時間等。在反應體系中加入 RNase 抑制劑也能有效防止 RNA 降解。另外，建議在進行逆轉錄前，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查 RNA 條帶的質量。通常完整的真核 RNA 應包括 28S、18S 條帶，且 28S 條帶強度一般是 18S 的兩倍左右。
Tips 2：RNA 定量
除了掌握 RNA 的完整性之外，反轉錄之前還需要對 RNA 濃度進行測定。一般反轉錄試劑盒會對上樣量有要求，建議 total RNA 上樣量小于 5 μg。超過這個范圍，會使反轉錄產物產生偏好性 (表達豐度高的基因優先被反轉錄) 而造成定量結果不準確。
Tips 3：去除基因組 DNA 污染
殘留的基因組 DNA (gDNA) 會對熒光定量結果造成很大的干擾，為了使結果更加的真實、可重復，我們需要去除 gDNA 干擾。我們可以在引物設計時避免 gDNA 的擴增，比如將上下游引物分別設在不同的外顯子上；或者在提取 RNA 后使用 DNase I 處理以除去 gDNA。最后，我們還有終極法寶——選擇一款具有 gDNA 去除功能的逆轉錄試劑盒，一步到位去除 gDNA，省心省力 max。
Tips 4：選擇合適的引物
Oligo dT 引物和隨機引物都能進行逆轉錄。Oligo dT 引物只能與 mRNA 的 3’ 端 poly (A) 結合，沒有 rRNA 和 tRNA 的干擾，特異性強。但其對 RNA 的完整度和二級結構的要求較高，而且不適用于原核生物。隨機引物可以根據堿基情況結合到幾乎所有的 RNA 上，包括 mRNA、tRNA 和 rRNA。但隨機引物法逆轉錄產生的片段較小，很難得到全長轉錄本的 cDNA。
單獨選擇某一種引物，實驗可能都不完美，具體需要根據實驗目的來確定。當然我們還可以選擇全都要！MCE RT mix 含有比例優化的 Oligo (dT) 和 Random Primers，使 cDNA 合成可從 RNA 轉錄本的各個區域起始，并具有相同的逆轉錄效率，最大程度保證 qPCR 結果的真實性和可重復性。
圖 2. Oligo dT 引物和隨機引物
Tips 5：逆轉錄酶熱穩定性
逆轉錄酶在整個反轉錄體系中具有關鍵性影響。除了活性以外，逆轉錄酶的熱穩定性同樣很重要，在較高溫度下進行逆轉錄，能夠減少 RNA 的二級結構，增加逆轉錄的效率。野生型的 M-MLV 逆轉錄酶很“怕熱”，高于 37℃ 時，穩定性大幅下降。MCE 逆轉錄試劑盒全面升級
采用熱穩定性大幅度提高的第三代逆轉錄酶，該酶可耐受高達 60℃ 的反應溫度，適合具有復雜二級結構的 RNA 模板的逆轉錄。
1、逆轉錄溫度 55℃，攻克復雜模板及高 GC 模板；
2、逆轉錄時間縮短至 15 min，高效逆轉錄；
3、合并 gDNA digester 與 gDNA digester buffer，使用更方便；
4、與模板的親和力增強，少量模板及低拷貝基因的逆轉錄同樣適用。
圖 3. 高 GC 基因表達量測定。模板 293T 細胞，RNA 投入 300 ng，反應體系 20 μL 55℃ 反應不同時間
|
Product Name |
夏日清涼福利 |
免費試用裝 |
|
SYBR Green qPCR Master Mix |
買一送一 |
|
|
RT Master Mix for qPCR |
買一送一 |
|
|
RT Master Mix for qPCR II |
買一送一 |
|
|
買一送一 |
/ | |
|
買一送一 |
/ | |
|
SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
買一送一 |
|
|
SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
買一送一 |
|
|
SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX) |
買一送一 |
|
|
2× PCR Master Mix (with Dye) |
買一送一 |
|
|
2× Fast PCR Master Mix (with Dye) |
買一送一 |
|
|
2× High-Fidelity PCR Master Mix |
買一送一 |
MCE 的所有產品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產品和服務
