流式細胞術(shù)的基本原理和常見應(yīng)用
流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）從字面意義理解，F(xiàn)low——Fluid、Cyto——Cell、Metry——Measurement，流式細胞術(shù)指的就是檢測流動細胞的一種技術(shù)，能在細胞流動的狀態(tài)下，快速檢測細胞或顆粒物的特異性指標(biāo)。它是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點，成為當(dāng)代最先進的細胞定量分析技術(shù)。基本原理
流式細胞術(shù)用到的儀器叫流式細胞儀（Flow cytometer ），是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來。目前廣泛應(yīng)用于外周血細胞的免疫表型分析、凋亡分析和細胞因子的檢測。
在一定的壓力下，鞘液帶著細胞或者微粒通過噴嘴中心進入到流式照射室，在流式照射室的分析點，激光照射細胞并發(fā)生散射和折射，發(fā)射出散射光，同時被熒光標(biāo)記的顆粒發(fā)射出熒光。散射光和熒光分別被不同的檢測器接收，通過光電倍增管將檢測到的熒光信號轉(zhuǎn)換成電信號，這些電信號放大后再經(jīng)過數(shù)據(jù)化處理輸入電腦，供我們進行分析。
流式細胞儀工作原理
流式通道
流式通道主要可以分為散射光通道和熒光通道。
流式細胞儀中能測定兩種方向的散射光信號，即FSC（前向角散射）和SSC（側(cè)向角散射）。
FSC的值代表細胞的大小：細胞體積越大，其FSC值就越大。所以可以利用細胞的FSC值初步比較細胞的大小，利用FSC值對細胞進行分群和分類。
SSC的值代表細胞的顆粒度：細胞越不規(guī)則，細胞表面的突起越多，細胞內(nèi)能夠引起激光散射的細胞器或者顆粒性物質(zhì)越多，其SSC值就越大。所以可以利用細胞的SSC值初步比較細胞的顆粒度，利用SSC值對細胞進行分群和分類。
因此，根據(jù)不同的 FS 和 SS 可將這些細胞分成不同的細胞群。樣品細胞不需要標(biāo)記任何熒光素偶聯(lián)抗體，直接上樣分析就可以得到樣品細胞的FSC值和SSC值，其值代表的是細胞的大小和顆粒度這兩個基本的物理特征，所以樣品的FSC-SSC散點圖又稱為樣品細胞的 “物理圖”。
熒光通道表示的不是細胞特有的物理特征，而是其化學(xué)特征。與根據(jù) FS 和 SS 區(qū)分細胞群類似，可根據(jù)是否表達特定蛋白區(qū)分細胞。這種情況下，通常使用熒光染料對目標(biāo)蛋白進行染色。用于檢測目標(biāo)蛋白的熒光染料被相應(yīng)激發(fā)波長的激光激發(fā)后會發(fā)射熒光。這些被熒光染色的細胞或顆粒會被單獨檢測。熒光通道接收到的信號越強，表示細胞上結(jié)合的熒光素越多，那么細胞表面表達的該CD分子就越多，因此可根據(jù)熒光信號的強弱判斷細胞表達該CD分子的相對數(shù)量。
常見流式圖
-流式直方圖-
流式直方圖本質(zhì)上就是統(tǒng)計直方圖，是累積顯示細胞量非常大而統(tǒng)計區(qū)間又非常小的統(tǒng)計直方圖。橫坐標(biāo)代表熒光信號或散射光信號的相對強度，可以是線性或?qū)?shù)坐標(biāo)；一般是相對細胞數(shù)。-流式散點圖-
散點圖十分利于兩參數(shù)圖，而兩個參數(shù)分別分布在x軸和y軸上，并且細胞計數(shù)以密度（點）圖或輪廓圖的形式顯示，可顯示其頻率分布，同時也可以不同的顏色以標(biāo)識給定位置的單元格密度。當(dāng)用象限標(biāo)記將散點圖分為四個部分時，在直方圖理解的基礎(chǔ)上，可知右上象限表示熒光標(biāo)記均為陽性或雙陽性細胞，而左下象限則恰恰是顯示兩個標(biāo)記均為負的細胞，左上象限和右下象限則分別代表只對y軸參數(shù)或x軸參數(shù)標(biāo)記為正的細胞。-等高線圖-
流式等高線圖的意義和實際應(yīng)用與流式散點圖較為相似，可以看作是流式散點圖的一個變體。相比之下，流式散點圖更為直觀，所以應(yīng)用也更為廣泛。當(dāng)然，流式等高線圖也有其自身的優(yōu)點，它較能直觀地體現(xiàn)細胞群的集中點，等密度環(huán)線的中央?yún)^(qū)域代表一個細胞群的集中點，一般代表一個細胞群，所以在某些情況下，流式等高線圖比流式散點圖更能直觀地體現(xiàn)細胞的分群。應(yīng)用
一、流式細胞術(shù)可以用來檢測細胞表面以及胞內(nèi)的各種標(biāo)志，對細胞進行分群鑒定以及各種蛋白表達量高低的比較。不僅僅是免疫細胞，其他的如腫瘤細胞、成纖維細胞、干細胞等都可以用流式細胞術(shù)進行檢測分析和分選。
二、通過標(biāo)記Ki67、BCL-2、caspases等增殖及凋亡相關(guān)基因，流式細胞術(shù)可用來檢測細胞的增殖以及凋亡。
三、流式細胞術(shù)可用來分析細胞周期。細胞核DNA含量隨著細胞增殖周期時相的不同而發(fā)生變化，用DNA染料進行染色，DNA含量多，熒光信號強，DNA含量少，熒光強度低。在腫瘤學(xué)研究中尤其常用，可以用于判斷藥物對腫瘤細胞影響、腫瘤的生長速度等。
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