在過去的幾十年里，基因治療在治療遺傳性疾病方面取得了重大進展。以基因組學或蛋白組學的方式找到致病基因，再結合細胞水平或動物水平驗證，用這種模式產出的高質量文章層出不窮。今天，小賽就借一篇文獻和大家聊聊點突變疾病研究的基本套路。

文章梗概
法洛四聯癥（TOF）是最常見的紫紺型先天性心臟病，通常被認為是遺傳和環境因素相互作用的結果。患者直系親屬和后代的先天性心臟病風險增加，說明了遺傳因素的貢獻。然而，對大多數患者而言，遺傳因素仍然難以捉摸。

人們之前發現，血管內皮生長因子（VEGF）信號傳導的失調與法洛四聯癥的發病機制有關，并發現一些患者編碼血管內皮生長因子受體2的基因（KDR）存在罕見變異。不過，他們并不清楚KDR變異在法洛四聯癥發病機制中的作用。

荷蘭阿姆斯特丹大學醫學中心領導的一個國際研究團隊近日在《Genetics in Medicine》雜志上發表文章，報道了KDR基因變異在法洛四聯癥發病中的作用。他們發現，罕見的KDR變異，特別是蛋白截短變異，與法洛四聯癥密切相關。未來在臨床診斷中可以考慮對法洛四聯癥患者進行KDR篩查。
 

獲得候選突變基因
在這項研究中，研究人員首先對一個摩洛哥血統的家族進行了外顯子組測序，該家族有兩個孩子患有嚴重的法洛四聯癥（圖1）。測序結果顯示兩名患者攜帶85個非同義或剪接位點變異，而且沒有一個是純和的。由于該家族疑似隱性遺傳，研究人員優先考慮雙等位基因變異。兩個基因包含多個罕見的變異。在對親本中的變異進行測試后，僅剩下一組經 Sanger 測序驗證的 KDR 復合雜合變異：KDR-p.(Gly345Trp)和KDR-p.(Gly537Arg)。另一個未患病的姐妹沒有攜帶任何KDR變異。
 

圖1. 家族譜系。兩個受影響的孩子用黑色符號標記，未受影響的父母和兄弟姐妹用白色符號標記。

KDR基因編碼了血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）。此次發現的這兩個變異位于VEGFR2的胞外免疫球蛋白樣結構域4和5中，并且受影響的殘基在進化上是保守的。此外，他們還在其他生物樣本庫中發現了帶有罕見KDR變異的法洛四聯癥患者。

構建點突變小鼠進行驗證
之后，研究人員委托賽業生物利用CRISPR-Cas9靶向系統生成了基因敲入小鼠品系，每個品系分別攜帶了兩個KDR變異的小鼠同源物。他們發現，Kdr-p.(Gly535Arg)與KDR-p.(Gly537Arg)同源）純合敲入小鼠再現了Kdr缺失小鼠的表型，表明這種純合變異對發育有嚴重的影響。胚胎切片的免疫熒光染色顯示 VEGFR2 在突變胚胎的心內膜細胞的細胞質中聚集，這在野生型同窩仔中基本上不存在（圖 2d），其中 VEGFR2 主要定位于細胞膜。
 

圖2. 攜帶KDR變異的點突變小鼠的表型

體外細胞實驗驗證
為了闡明兩個KDR變異的生物學機制，研究人員隨后分析了VEGFR2上酪氨酸1175（Tyr1175）位點的磷酸化。這是VEGFR2的主要磷酸化位點之一，對下游信號級聯中蛋白質的募集至關重要。

他們用VEGF165來刺激異源表達兩個變異或野生型KDR（對照）的HEK 293T細胞。Western blot分析結果表明，與野生型相比，這兩個變異導致Tyr1175位點的磷酸化水平顯著降低。同樣地，對于來自敲入小鼠胚胎的卵黃囊細胞，VEGFR2的磷酸化水平也明顯降低。其中，KDR-p.(Gly537Arg)變異的功能影響更為嚴重。
 

圖3. 磷酸化分析

總的來說，來自該家族的遺傳數據以及在小鼠和體外獲得的數據支持該家族中兩種罕見的 KDR 錯義變體的作用，其中 KDR-p.(Gly537Arg) 變體的功能影響比 KDR-p.(Gly345Trp) 的嚴重。

臨床驗證
最后，研究人員通過比較罕見變異在法洛四聯癥患者和對照上的負荷來探索KDR變異的致病作用。他們對一組共1,569名歐洲血統的法洛四聯癥患者開展變異負荷分析。與對照組相比，法洛四聯癥患者出現蛋白質截短變異（PTV）的比例大約高了46倍。1,569個病例中有9個PTV，而56,699個對照中有7個PTV（P = 7 × 10-11）。同時，法洛四聯癥患者的KDR錯義變異比例也更高，但沒有統計學意義。

小結
作者認為，罕見的KDR變異，特別是蛋白質截短變異，與法洛四聯癥密切相關，可能存在不同的遺傳模式。有了遺傳學以及體內外功能分析的支持，他們認為VEGFR2的功能缺失是引起法洛四聯癥的機制之一，未來在臨床診斷中可考慮對法洛四聯癥患者進行KDR篩查。

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中國科學院生物化學與細胞生物學研究所周斌課題組與交通大學國際婦幼保健院黃荷鳳團隊在Circulation雜志上發表了題為“In Vivo AAV-CRISPR/Cas9-mediated Gene Editing Ameliorates Atherosclerosis in Familial Hypercholesterolemia” 的文章。發現了AAV-CRISPR/Cas9系統對攜帶Ldlr突變的小鼠（賽業生物構建）進行的LDLR基因校正能夠部分地修復LDLR表達并有效改善LDLR突變體中的動脈粥樣硬化，為FH患者的治療提供潛在的治療方法。
 

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原文檢索：

Škorić-Milosavljević, D., Lahrouchi, N., Bosada, F.M. et al. Rare variants in KDR, encoding VEGF Receptor 2, are associated with tetralogy of Fallot. Genet Med (2021). https://doi.org/10.1038/s41436-021-01212-y