之前說到光片顯微鏡以其較高的三維空間分辨率、良好的光學切片能力和較高的成像速度而備受關注。但是由于衍射極限導致的光片形狀限制（見光片技術小課堂二2.1），當需要大視場時，會導致較低的軸向分辨率或較差的光學切片能力。因此，如何產生出厚度均勻且薄，又大到能覆蓋視場的激發光片成為光片顯微鏡的關鍵問題。目前已經有很多不同的方法來嘗試在光片顯微鏡中產生這樣的光片，例如高斯光片、貝塞爾光片和晶格光片。然而無論采用何種方法，這種光片自身特性的相互限制對所有類型的光片都是存在的，而且當我們需要用亞微米厚度的光片去對幾十微米或更大的視場進行成像時，這個問題尤其具有挑戰性。
 
Dean和Fiolka首先提出了一種解決方案，通過使用聚焦可調的透鏡沿光的傳播方向掃描激發光的焦點，從而可以創建長而均勻的虛擬激發光束，并且可以通過掃描虛擬激發光束進一步生成大而均勻的虛擬激發光片。但是這種方法有兩個局限性，第一是由于掃描過程中激發光束尾跡的混合使得用這種方法產生的光片對激發光的限制很差，因此光學切片的能力較差，必須與共焦檢測一起使用以抑制熒光背景；其次，由于產生的激發光片是一個虛擬光片，因此在一個相機曝光周期內，焦點必須掃描整個視場，因此在視場內任何特定位置的實際曝光時間都非常短，必須使用相對較高的激發功率才能產生足夠的熒光信號，從而導致更強的光毒效應。

 


在這之后，西湖大學的高亮博士提出了一種在不增加光片厚度或降低光約束力的情況下提高光片顯微鏡視場的替代方案。如圖1所示，可以通過沿光片長度方向在檢測光路的焦平面內平鋪光片并在每個位置拍攝圖像來代替使用較大的激發光片對大視場進行成像。然后，將所有圖像組合在一起，重建整個視場的圖像。盡管這種方法降低了成像速度，但其所帶來的好處是顯而易見的，采用更薄的光約束能力越好的光片對同一樣品進行成像，可以獲得更高的軸向分辨率和更好的光學切片能力。

 
圖1 該圖展示了該方法的工作原理，同樣的視野可以通過沿著光片長度方向平鋪更小但更薄的光片并拍攝額外的圖像來成像。
 
為了在實際中實現這一方法，在成像過程中樣品或激發光束必須沿光束方向快速移動。高亮博士選擇通過使用純相位空間光調制器（spatial light modulate, SLM）對光束進行離焦來移動激發光束，因為無論是移動樣品還是激發物鏡都太慢。此外由于光片顯微鏡中激發物鏡和檢測物鏡之間的物理約束，激發物鏡的NA通常小于0.6，因此激發光束可以在對其橫向光強分布影響很小的情況下離焦幾百微米。

接下去高亮博士在前期嚴格的數字模擬后通過兩個實際成像實驗驗證該方法的可行性，首先
是用1.5%瓊脂糖凝膠包埋100nm黃綠色熒光粒子來驗證該方法的成像性能，結果如下：圖2(a) – 2(c)展示了在三個不同激發光束位置（左、中、右）下為同一視場采集的三個三維圖像堆棧的軸向最大值投影；圖2(d) – 2(f)展示了相應的去卷積圖像結果；圖2(h) – 2(m)展示了選定的相同熒光粒子在去卷積前后的高分辨率對比視圖，以及每個選定粒子的軸向強度圖。


 
圖2 用平鋪光片方法對嵌入瓊脂糖凝膠中的熒光粒子進行三維成像。(a-c) 在激發光片分別位于視場的左側(a）、中間(b)和右側(c)時的同一視場下的YZ最大值投影；(d-f) YZ去卷積后的最大值投影；(h-m) 同一視場不同區域中所選熒光粒子的放大視圖與軸向強度圖；比例尺：a為5µm，h為1µm。
 

如圖2所示，在每個光束位置由于與視場相比激發光束長度更短，因此在相應的子區域中獲得了比其余區域更高的軸向分辨率，通過在三個位置平鋪激發光片，可以在整個視場內獲得~500nm的均勻軸向分辨率。
 
第二個實驗通過對在3折疊期的活體線蟲胚胎成像進一步證明了其成像性能。在這個階段，胚胎內大約有550個細胞，這種胚胎的細胞結構非常致密，它會引起強烈的光學像差和散射。為了獲得具有亞微米軸向分辨率和高信噪比的三維圖像，需要具有良好的光學切片能力。在三個位置之間移動相同的激發光束以成像整個胚胎，胚胎的橫向最大值投影如圖3(a)所示。為了更好地揭示胚胎的內部細胞結構，圖3(b) – 7(d)展示了在不同光束位置下沿水平虛線的胚胎截面圖，圖3(e) – 3(g)展示了沿三條垂直虛線的胚胎截面圖。盡管胚胎的結構復雜，光學像差大，但由于使用了具有良好光約束力的薄激發光束，通過移動激發光束并拍攝額外的圖像，整個胚胎能夠如預期那樣以~500nm的軸向分辨率和高信噪比成像。


圖3 用平鋪光片方法對3折疊期線蟲胚胎進行了三維成像。(a) 胚胎XY最大值投影；(b-d) 在激發光片位于胚胎的左側(b)、中間(c)和右側(d)時胚胎沿(a)所示水平線的YZ截面圖；(e-g) 沿(a)所示三條垂直線處的胚胎XZ截面圖。比例尺：a為5µm，b和e為2µm。
 
高亮博士在該研究中提出并展示了一種新的使用光片顯微鏡進行的三維成像方法，能夠在獲得高三維空間分辨率和良好的光學切片能力的同時獲得大視場。與以前實現這一目標的解決方案相比，它沒有試圖擴展光片的尺寸至足夠覆蓋整個視場，而是通過使激發光束離焦并拍攝同一圖像平面的多個圖像，將相對較小的激發光片平鋪到多個位置。通過這個方法，在只降低成像速度的情況下能獲得具有更薄厚度和更好的光約束力的光片。高亮博士提出的方法是很有價值的，首先，盡管已經引入了不同種類的光片來提供對該問題的解決方案，但這些方案無論是使用什么方法產生的激發光片，仍普遍是將光片變得更厚或者增加光片的尺寸導致光約束力（即光學層切能力）變得更差，這樣的思路由于光的衍射極限的限制，不可能有完美的解決方案。因此，該方法是在軸向分辨率、光學切片能力和視場均不受影響的前提下，提供的一種新的策略。其次，所提出的方法對任何類型的光片顯微鏡都是有效的，這意味著使用同一種尺寸較小、厚度較薄且光約束能力較好的光片，可以從同一樣品中獲得更高的軸向分辨率和更好的光學切片能力。锘海LS18平鋪光片顯微鏡正是使用了這一優秀且巧妙的技術作為產品的核心技術，旨在為廣大生命科學研究者提供更好更優秀的成像工具及成像技術。
 
 
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