新時代下對于Western Blotting發表文章的新要求（一）

瀏覽次數：1725　發布日期：2020-3-13　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

Western Blotting技術已經問世四十多年了，依然是蛋白分析中最常用和主流的方法。但近些年Western Blotting數據重現性，穩定性，定量準確性等問題，也使這項技術被推到了風口浪尖，同時也有很多文章因為Western Blotting數據的問題而撤稿，而為了盡可能提高Western Blottig數據的可靠性和準確性，期刊雜志對于接收涉及Western Blotting技術數據的文章也提出了新的要求。

接下來我們看看都要哪些要求：

1.不建議跑平行膠，因為平行膠和剝離膜孵育體系，操作條件的不一致，影響定量的準確性，因此最好內參和目的蛋白要在同一張印跡膜上

2.選擇寬態范圍的方法，確認信號強度與所上樣量之間的線性關系，例如用膠片做化學發光方法的動態范圍就很窄，不建議使用：

數字成像相比膠片動態范圍更寬、定量更準確

3.強烈推薦使用總蛋白進行歸一化，因為看家蛋白容易受處理條件影響而發生變化，影響定量的結果，使用總蛋白定量更真實地反映目標蛋白表達量的變化

4.提交原始數據，例如：JBC，PLOS和CELL等雜志都要求要提供原始數據

聊完了期刊雜志的一些要求，那Azure Sapphire雙模式多光譜激光成像系統是如何幫助您獲得滿足期刊雜志Western Blotting要求的數據：

★ Sapphire是多熒光檢測系統，可多達4個激光光源，同時進行4通道熒光檢測，獲得更快的工作流程和更可靠的定量數據

熒光Western Blotting使用熒光基團標記的二抗進行檢測，膜上的靶標蛋白濃度與可見熒光信號強度呈線性關系，實現真實可靠的定量分析。熒光染料發射光譜不同，因此在一張印跡膜上可實現多個蛋白檢測。這樣目標蛋白和內參蛋白在同一張膜上，就可以避免數據造假的情況發生，更容易被期刊雜志接收。

圖1：通過使用四種光譜不同熒光基團標記的二抗，可以同時檢測多達四種不同的蛋白。HeLa細胞裂解物上樣，anti-tubulin (550nm, 綠色), anti -actin (700nm紅色), anti-GAPDH (800nm, 灰色),和anti-transferrin (490nm, 藍色)這四種蛋白同時成像，沒有交叉。

★ Sapphire配合AzureRed總蛋白熒光染色劑可以做總蛋白歸一化和定量三個靶標蛋白，生成可以信賴的定量Western Blotting數據

使用總蛋白歸一化，以校正泳道和樣品之間的差異。傳統的方法無法準確知道條帶灰度值和強度的變化是由于樣品的生物學變化引起的，還是由于上樣或樣品的不一致性或樣品制備的差異引起的。總蛋白歸一化優勢如下：

☑ 總蛋白比看家基因等內參的線性檢測范圍更寬。

☑ 在整個實驗和系統中更加穩定。

☑ 能有效排除實驗條件和體系對結果的影響。

☑ 更真實地反映目標蛋白表達量的變化。