驗證抗體對于WB結(jié)果的一致性和重復(fù)性是至關(guān)重要的，即確認(rèn)抗體能特異性識別感興趣的蛋白，抗體與其他蛋白的交叉反應(yīng)性情況。在您的論文提交給期刊發(fā)表之前，經(jīng)常需要驗證抗體的特異性，但并非所有人都花時間進(jìn)行驗證。或者很多人都認(rèn)為他們使用抗體進(jìn)行了免疫共沉淀驗證，因而不需要再通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行驗證。然而，抗體與抗原的親和性高度依賴于實驗條件，因此，驗證您的試驗方法中的條件適用于抗體與抗原的結(jié)合是十分重要的。在《JBC》雜志中關(guān)于抗體驗證信息如下：

• 定義所有使用的抗體的來源和種類，包括目錄/批號。
• 描述如何產(chǎn)生新抗體，包括表位/抗原的制備和純化。
• 描述支持抗體特異性的數(shù)據(jù)，包括翻譯后修飾或新表位。

定量western blot尤其適用于確認(rèn)獲得的信號僅來自感興趣的蛋白。如果沒有進(jìn)行抗體驗證（并且驗證熒光信號與蛋白質(zhì)的量呈線性關(guān)系），將無法獲得下游定量分析所需的準(zhǔn)確度和精確度。
為確保實驗質(zhì)量，國際抗體驗證工作組提供了五種不同的抗體驗證方法，其中四種方法適用于western blot，他們建議至少使用其中兩種方法進(jìn)行抗體驗證。​
遺傳策略
用CRISPR-Cas9或RNA干擾（RNAi）在實驗組和對照組中進(jìn)行敲除或敲低實驗，然后使用特異性抗體測定目標(biāo)蛋白的熒光信號。處理后的目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)很少甚至沒有，所以觀察到的任何信號都表明抗體存在交叉反應(yīng)性。
如下圖所示，將具有特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物進(jìn)行western blot，分別使用兩種不同siRNA分子敲低目的蛋白的表達(dá)，如泳道1和泳道2，與泳道C的對照組相比，我們可以看出siRNA脫靶帶來的影響。 正交策略
不依賴于抗體的方法（質(zhì)譜法）來量化幾個蛋白樣品的靶信號，然后使用基于抗體的方法（western blot）同樣量化相同蛋白樣品的靶信號，最后將他們的信號值進(jìn)行比較。例如，有幾種靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法可以量化不同樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)。當(dāng)對抗體進(jìn)行標(biāo)記時應(yīng)參考這些相關(guān)的定量數(shù)據(jù)。
下圖比較了蛋白質(zhì)印跡和質(zhì)譜法測定蛋白表達(dá)量的相關(guān)性。通過對八種細(xì)胞系中蛋白表達(dá)量的測定，我們可以看到他們的相關(guān)性高達(dá)0.97，表明該抗體對于蛋白質(zhì)印跡分析是有效的。 獨(dú)立抗體策略
使用針對相同靶標(biāo)的兩種或更多種不同抗體是測量抗體特異性的直觀且有效的方法。在相同的實驗條件中測定抗體相關(guān)性十分重要。如果抗體具有不同的抗體表位（即抗體結(jié)合抗原的不同區(qū)域）則表明該抗體是獨(dú)立的。這樣，它們不可能表現(xiàn)出脫靶效應(yīng)并結(jié)合與該研究無關(guān)的同一蛋白質(zhì)，這種方法可結(jié)合敲除或敲低的方法一起使用。
如下圖，對目的蛋白使用了兩種獨(dú)立的抗體，并且我們可以確定來自八種細(xì)胞系中的每一種信號的相關(guān)性。注意要檢查整塊凝膠，因為脫靶效應(yīng)帶來的結(jié)果是非特異條帶可能在整塊膠的任意位置。 表達(dá)帶有標(biāo)簽的蛋白
還可以通過表達(dá)具有親和標(biāo)簽（例如FLAG或v5）或熒光蛋白（例如GFP或YFP）的蛋白質(zhì)來驗證抗體。 然后可以使抗體表達(dá)與另一種方法的表達(dá)相匹配，但是這種方法局限性在于最好標(biāo)記內(nèi)源基因。值得注意的是過表達(dá)目標(biāo)蛋白可能會人為地淹沒脫靶結(jié)合，然后無法驗證抗體。 驗證抗體對于western blot實驗十分重要，并且western反過來可以用來驗證ELISA或者IHC。
Azure有相應(yīng)成像產(chǎn)品和試劑幫助確認(rèn)您的抗體是否具有特異性和選擇性結(jié)合：
（1）HRP偶聯(lián)的二抗：可用來檢測化學(xué)發(fā)光WB中的低豐度蛋白質(zhì)；
（2）熒光二抗 ：在熒光Western blot中發(fā)射可見光和近紅外波長的光。
（3）Azure600多功能成像系統(tǒng)和sapphire雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)可進(jìn)行WB成像