穩(wěn)轉株即穩(wěn)定表達細胞株，指的是基于某一細胞系構建的持續(xù)過表達或干擾某特定基因的細胞系。慢病毒感染-藥物篩選法是目前廣泛應用的穩(wěn)轉株構建方法，具有高效整合、目標細胞廣泛等特點。

 

一．準備及預實驗

• 確定細胞系相關信息，需包括如下內容

目標細胞系培養(yǎng)條件

目標細胞增殖速度

支原體污染情況

注：為避免慢病毒感染后細胞死亡，務必保證細胞無支原體污染！ 

• 預實驗確定MOI值

• 查閱文獻確定慢病毒在目標細胞系中的MOI；
• 參考查閱得到的數(shù)據(jù)，設計梯度實驗，摸索最適MOI。

• 預實驗確定篩選藥物用量：

• 查閱Puromycin/Blastincidin等在目標細胞系中穩(wěn)轉株篩選的致死用量信息；
• 參考查閱得到的數(shù)據(jù)，確定3個藥物濃度梯度（如沒有相關信息，則需將藥物濃度梯度范圍增大，數(shù)量增多至6個）；
• Day0將細胞鋪于6孔板中，使Day1細胞融合度約90%；
• Day1按（2）中設置的藥物梯度，加入藥物；
• Day4換液，并重新加入藥物； 
• Day7觀察，找到致死率100%的孔，該孔使用的藥物濃度，即為藥物篩選濃度。

附1：經驗篩選藥物用量

 

二．穩(wěn)轉株篩選及構建

注：以下實驗參數(shù)，按1株穩(wěn)轉株為例描述，實驗需考慮有無對照穩(wěn)轉株！

• 細胞鋪板：

將細胞接種于6孔板中（4個孔），使次日細胞融合度約70%

• 病毒感染：

根據(jù)預實驗確定的MOI值，計算慢病毒體積，添加慢病毒（每孔添加ADV-HR 2μL）；

• 換液：

慢病毒感染次日，將細胞進行換液處理；

• 觀察感染效率：

感染后72小時，觀察感染效率，效率最低不應低于40%。

• 篩選：

• 多克隆穩(wěn)轉株：從感染72小時后開始于6孔板中加篩選藥物，每隔2天，重新?lián)Q液加入藥物。藥物篩選需至少持續(xù)14天，直至顯微鏡下觀察熒光細胞比例為100%。

注：第一次加入藥物時在上午進行，4-6小時后觀察細胞狀態(tài)，如細胞死亡過多，需更換新鮮不含藥物的培養(yǎng)基。

附2：多克隆穩(wěn)轉株

 

多克隆穩(wěn)轉株的熒光通常強弱夾雜。

• 單克隆穩(wěn)轉株：建立在獲得多克隆穩(wěn)轉株基礎上

• 有限稀釋法：

 

 

• 取24個1.5毫升EP管，每管中加入800微升完全培養(yǎng)基；
• 用胰酶將多克隆穩(wěn)轉株消化（90%融合度，10毫升培養(yǎng)基終止消化），取80微升至第一個EP管中，混合均勻

注：應使用1000微升槍尖，混合時不要過度吸打，以免破壞細胞。

• 從第一個EP管中取80微升至第二個EP管中，混合均勻，以此類推。
• 將EP管中的細胞懸液，以每孔100微升，接種于96孔板中；
• 過夜培養(yǎng)后，觀察第12-24列，尋找只含有1個細胞的孔，并做好標記；
• 培養(yǎng)3-4周，待標記孔中細胞擴增后，消化傳代擴增，即為單克隆穩(wěn)轉株細胞。

注：培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

• 平板挑取法

 

• 計數(shù)100個多克隆穩(wěn)轉株細胞，接種于一個10cm培養(yǎng)盤中；

注：盡量吹打均勻，防止細胞聚團。

• 過夜培養(yǎng)后，觀察并尋找單個細胞的位置，并在盤底做標記；
• 培養(yǎng)培養(yǎng)2周；

注：培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

• 待標記處的細胞擴增為肉眼可見的白點，在移液器尖端吸取一點胰酶，緩慢滴至細胞處，待細胞消化后，迅速吹打，將消化下的細胞轉移至96孔板中，傳代擴增，即為單克隆穩(wěn)轉株細胞。約需2-3周的時間。

注：每盤選取20個為宜，在消化時，需按照先消化邊緣的，再消化中心的原則，防止克隆之間的相互污染。培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

附3：單克隆穩(wěn)轉株

 

單克隆穩(wěn)轉株的熒光強度基本一致。

 

三、穩(wěn)轉株構建中的常見問題

1.支原體污染問題

由于輕度的支原體污染并不影響細胞的生長和增殖，故被許多實驗室所忽略。但支原體易在病毒感染細胞后爆發(fā)，出現(xiàn)大量細胞碎片，甚至導致細胞死亡，導致穩(wěn)轉株篩選的失敗。我們建議在穩(wěn)轉株構建之初，務必排除細胞及培養(yǎng)環(huán)境中的支原體污染。

2. 其他問題

除支原體污染之外，還有以下問題會經常出現(xiàn)于穩(wěn)轉株構建中。