P1噬菌體轉導試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

P1噬菌體轉導試劑是一種旨在通過供體大腸桿菌制備具有部分細菌基因的噬菌體，感染特定受體大腸桿菌，獲得細菌之間基因片段的轉移，而獲得遺傳重組的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于通用型非特異性基因片段的轉導。產品嚴格無菌，即到即用，性能穩定，轉導效率高。

技術背景

噬菌體（bacteriophage或phage）是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物，并使其細胞裂解死亡的病毒，本世紀初在葡萄球菌和志賀菌中首先發現。噬菌體具有病毒的一些特性：個體微小，可以通過濾菌器；沒有完整的細胞結構，主要由蛋白質構成的衣殼和包含于其中的核酸組成；只能在活的微生物細胞內復制增殖，是一種專性細胞內寄生的微生物。在含細菌的固體培養基上，噬菌體使細菌細胞裂解而形成的空斑，稱為噬菌斑。每個空斑都是由一個噬菌體顆粒一再侵染、增殖、裂解所形成的，故可用于進行噬菌體的計數。由于噬菌體結構簡單、基因數少，容易獲得大量的突變體，因此是研究核酸以及核酸與蛋白質相互作用的重要工具，是分子生物學與基因工程的良好實驗系統。P1噬菌體是一種針對大腸桿菌的通用型轉導噬菌體，既可以包裝（packaging），又能轉導，成為微生物基因組非特異性基因片段（長達100kb）操作的標準化模型工具。 

產品內容

專養液（Reagent A） 毫升

溶解液（Reagent B）      毫升

普養液（Reagent C） 毫升

轉導液（Reagent D） 毫升

強化液（Reagent E） 毫升

產品說明書         1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

P1噬菌體：用于轉導的噬菌體

供體/受體宿主細菌：用于噬菌體轉導的目標

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

9cm直徑細菌培養皿：用于受體細菌選擇培養的容器

培養箱：用于細菌培養

恒溫搖床：用于宿主細菌培養

微型臺式離心機：用于樣品操作

實驗步驟

一、P1噬菌體制備

• 移取xx毫升專養液（Reagent A）到15毫升錐形離心管
• 加入50微升用戶自備的過夜新鮮培養的供體宿主細菌（10⁸ 細菌/毫升）
• 放進37℃恒溫搖床孵育45分鐘，速度為220RPM
• 加入100微升用戶自備的P1噬菌體（5 X 10⁹ PFU/毫升），混勻
• 放進37℃恒溫搖床孵育3小時或直至細菌完全溶解，速度為220RPM（注意：光線下未見漂浮的顆粒碎片）
• 加入xx微升溶解液（Reagent B），混勻
• 放進37℃恒溫搖床孵育5分鐘，速度為220RPM
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為9200g
• 移取4毫升上清液到新的15毫升錐形離心管
• 放進4℃冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、噬菌體轉導

• 移取xx毫升普養液（Reagent C）到15毫升錐形離心管
• 加入5微升用戶自備的受體宿主細菌（10⁸ 細菌/毫升）
• 放進37℃恒溫搖床孵育過夜，速度為220RPM
• 移取1.5毫升菌液到新的1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心2分鐘，速度為16000g
• 小心去掉上清液
• 加入xx微升轉導液（Reagent D），混勻顆粒群
• 準備好4個1.5毫升離心管，標記為1至4號管
• 分別加入100微升上述制備的受體宿主細菌到每個離心管
• 移取xx微升上述制備的P1噬菌體到1號管，混勻
• 移取xx微升上述制備的P1噬菌體到2號管，混勻
• 移取xx微升上述制備的P1噬菌體到3號管，混勻

• 室溫下孵育30分鐘
• 分別加入xx毫升強化液（Reagent E），混勻
• 放進37℃恒溫搖床孵育1小時，速度為220RPM
• 放進微型臺式離心機離心2分鐘，速度為16000g
• 小心去掉上清液
• 加入xx微升普養液（Reagent C），混勻顆粒群
• 鋪板在用戶自備的90mm直徑的瓊脂糖選擇細菌培養基上（注意：含有抗生素等選擇培養基）
• 倒置細菌培養皿
• 放進37℃培養箱孵育16小時
• 觀察和計數——對照組無菌落生長；P1噬菌體量越多，轉導體細菌菌落越多
• 挑選1個獨立的菌落
• 在用戶自備的90mm直徑的瓊脂糖選擇細菌培養基上劃線分離
• 倒置細菌培養皿
• 放進37℃培養箱孵育16小時
• 重復實驗步驟23至26一次
• 后續鑒定陽性轉導體菌落：PCR擴增或測序

注意事項

• 本產品為20次操作
• 整個操作須無菌操作
• 使用時，切莫污染母液
• 通常使用P1virW3110噬菌體為佳
• 通常的宿主細菌含有遺傳標記，便于篩選
• 本產品可以獲得100至1000轉導體菌落/毫升PI噬菌體
• 如果需要徹底去除殘余菌體，獲得不含宿主細菌的噬菌體原液，可以使用0.45微米孔徑的過濾器過濾
• P1噬菌體制備后的效價鑒定，建議使用 P1噬菌體效價檢測試劑盒——60091
• 選擇培養基的抗生素參考劑量如下

• 本公司提供系列噬菌體實驗產品

質量標準

• 本產品經鑒定無細菌污染
• 本產品經鑒定繁殖效價高