致瀉大腸埃希氏菌鑒定劑盒（pcr法）使用說明

瀏覽次數：4579　發布日期：2018-3-20　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

致病微生物系列

致瀉大腸埃希氏菌鑒定劑盒（PCR法）

產品說明

致瀉大腸埃希氏菌鑒定劑盒參照《GB4789.6—2016 食品安全國家標準食品微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗》進行設計，可針對食品樣品中的致瀉大腸埃希氏菌特異核酸片段進行擴增，通過電泳判斷樣品的鑒定結果。該產品檢出限為10^3 cfu/ml（使用旋達071021M細菌基因組DNA提取試劑盒提取1 ml 10^3cfu/ml增菌液的細菌基因組DNA作為模板）。

一管式檢測試劑為本公司研發的產品，與傳統PCR法檢測試劑具有等效的檢測性能，其中的固封液不影響檢測反應與熒光檢測性能，并且對試劑蒸發與氣溶膠污染起到一定的防范作用。該產品無需分裝試劑，有效減少反復凍融及分裝過程中造成的試劑活性下降及試劑污染，無需增設試劑配置區，省時省力省空間。（該產品反應液中已含熒光染料，可直接使用熒光定量PCR儀進行定性檢測）

◆ 產品組成（96測試）

試劑		含量	作用
孔1	反應液-uidA	23μl/孔 12孔/排 8排（本產品使用12聯PCR管分裝，每排含12種反應液各23ul）	內參
孔2	反應液-ipaH		鑒定EIEC
孔3	反應液-pic		鑒定EAEC
孔4	反應液-aggR		鑒定EAEC
孔5	反應液-astA		鑒定EAEC
孔6	反應液-stx1		鑒定EPEC與EHEC
孔7	反應液-stx2		鑒定EPEC與EHEC
孔8	反應液-bfpB		鑒定EPEC與EHEC
孔9	反應液-escV^a		鑒定EPEC與EHEC
孔10	反應液-lt		鑒定ETEC
孔11	反應液-stp		鑒定ETEC
孔12	反應液-sth		鑒定ETEC
NG-Ecoli		100μL × 1支	陰性對照
NG-DW		100μL × 1支	空白對照
PG-Ecoli		100μL × 1支	陽性對照
Loading Buffer		600μL×1支	電泳上樣緩沖液

◆ 所需儀器

ABI ，BioRad，TaKaRa等PCR擴增儀，電泳儀，凝膠成像儀等電泳配套設備。（使用熒光定量PCR儀進行定性判讀時則無需電泳設備）

◆ 自備耗材和儀器

①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②冰盒；③移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；④離心機；⑤渦旋混勻器；⑥金屬浴。

◆ 樣品處理

參照《GB4789.6—2016 食品安全國家標準食品微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗》中的操作步驟進行前增菌。建議使用試劑配套細菌基因組DNA提取系列產品。

◆ 實驗操作

1．添加模板（樣本制備區，放置于冰盒中進行）

取所待檢樣品數+3的12聯反應管，將試劑完全解凍，分離心30s。離心后揭開封口膜，使用穿刺加樣法穿過固封層向每管反應液中分別加入2μL模板（或直接使用無菌吸頭挑取少許待檢菌落至反應管中）。

加樣示例：（有2個待測樣品）

取5排12聯反應管，按順序第一排全部加NG-DW，第二排全部加NG-Ecoli，第三排全部加樣品1，第四排全部加樣品2，第五排全部加PG-Ecoli。

蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應。

2. 擴增反應（擴增及產物分析區）

按下列條件設置擴增反應：（如需使用熒光法進行檢測請選擇FAM通道）

PCR循環			熒光收集位點
95℃	10分鐘	1個循環	—
95℃	30秒	30個循環	—
63℃	30秒		—
72℃	90秒		※
72℃	5分鐘	1個循環	—

3. 產物電泳（擴增及產物分析區）

稱量4. 0g瓊脂糖粉，加入至200 mL的1×TAE電泳緩沖液中，充分混勻。使用微波爐反復加熱至沸騰，直到瓊脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待瓊脂糖溶液冷卻至60℃左右時，加入溴化乙錠( EB )至終濃度為0.5μg/mL，充分混勻后，輕輕倒入已放置好梳子的模具中，凝膠長度要大于10cm，厚度宜為3mm~5mm。檢查梳齒下或梳齒間有無氣泡，用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡。當瓊脂糖凝膠完全凝結硬化后,輕輕拔出梳子，小心將膠塊和膠床放入電泳槽中，樣品孔放置在陰極端。向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，液面高于膠面1mm~2mm。將 5μL PCR產物與1μL 6×上樣緩沖液混勻后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下膠孔，小心上樣于孔中；陽性對照的 PCR 反應產物加入到最后一個泳道;第一個泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通電泳儀電源，根據公式：電壓=電泳槽正負極間的距離（cm）×5V/cm計算并設定電泳儀電壓數值；啟動電壓開關，電泳開始以正負極鉑金絲出現氣泡為準。電泳30min~45min后，切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀察結果，拍照并記錄數據。

可使用Gold view、Gal-Rad等等效的核酸熒光染料替代EB。
推薦使用DNA Marker：DL2000或100bp ladder，等可指示100bp~1500bp條帶的Marker。

結果分析

陰陽性判讀：

進行電泳檢測時，需對比Marker進行判斷，當目的靶標對應位置出現單一顯著條帶時可判斷該靶標為陽性；否則為該靶標檢測為陰性。（使用熒光定量PCR儀檢測時，檢測孔Ct≤30時判斷該孔為陽性；當檢測孔Ct＞30時，該檢測孔為陰性）

示例電泳圖

有效性判讀：

需同時滿足：1.空白對照中所有泳道均為陰性；2.陰性對照中uidA泳道陽性，其余泳道陰性；2.陽性對照中所有泳道陽性，此時可判斷實驗有效。如無法滿足上述條件，則實驗無效，需重復實驗；如重復后結果仍為無效，請于本公司技術支持聯系。

結果判讀：

在實驗有效的情況下，可根據下表進行判讀：

致瀉大腸埃希氏菌類別	目標條帶的種類組合
EIEC	ipaH（＋）	uidA （＋／－）
EAEC	aggR，astA，pic中一條或一條以上陽性
EPEC	bfpB（＋／－），eae（＋），stx1（－）stx2，（－）
STEC/EHEC	stx1，stx2中一條或一條以上陽性，eae（＋／－），bfpB（－）
ETEC	lt，stp，sth中一條或以上陽性