基于數(shù)字全息顯微術(shù)的登革病毒感染C6/36細(xì)胞的3D形態(tài)學(xué)

數(shù)字全息顯微術(shù)是近年來(lái)開始應(yīng)用于活細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究的新技術(shù)。采用了數(shù)字全息技術(shù)與顯微技術(shù)相結(jié)合方法，特異性測(cè)量細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞面積、厚度及體積等細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)估參數(shù)，提供空間、時(shí)間、高分辨率的三維形態(tài)學(xué)圖像，經(jīng)數(shù)據(jù)處理轉(zhuǎn)化為細(xì)胞增殖、遷移、活性和細(xì)胞死亡等細(xì)胞變化過(guò)程［13-16］。數(shù)字全息顯微術(shù)已逐漸應(yīng)用于細(xì)胞水平機(jī)制研究中，如通過(guò)實(shí)時(shí)成像技術(shù)從原理到應(yīng)用全過(guò)程研究各個(gè)階段細(xì)胞的病理生理學(xué)改變［17］。目前登革病毒感染機(jī)制主要通過(guò)對(duì)相關(guān)蛋白、細(xì)胞通路、細(xì)胞因子等方面的表達(dá)與調(diào)控進(jìn)行深入研究，然而對(duì)侵襲過(guò)程中病毒-細(xì)胞膜融合的構(gòu)象改變形式和方向缺乏有效的研究方法。因此，本研究借助HoloMonitor M4全息細(xì)胞成像及分析系統(tǒng)，對(duì)登革病毒感染宿主細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，定量分析病毒感染過(guò)程中細(xì)胞面積、厚度及體積等各項(xiàng)三維參數(shù)的變化，有助于闡明登革病毒感染細(xì)胞的細(xì)節(jié)。同時(shí)，此方法對(duì)于其他病毒感染機(jī)制研究同樣適用，為研究病毒感染過(guò)程中的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化提供了新方向。

結(jié)果與分析

2.1 C6/36細(xì)胞全息細(xì)胞成像儀下的最佳成像密度

在接種細(xì)胞量方面設(shè)立10⁵、2×10⁵、4×10⁵、8×10⁵、10⁶個(gè)/孔等5個(gè)不同條件，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞三維形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞參數(shù)分析，確定開展登革病毒感染C6/36細(xì)胞三維形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)最佳密度。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)3中細(xì)胞接種量為4×105時(shí)C6/36細(xì)胞貼壁后單個(gè)細(xì)胞生存空間充足，呈良好的圓形三維形態(tài)，細(xì)胞間形態(tài)學(xué)表現(xiàn)一致，提示細(xì)胞三維成像具有較高統(tǒng)一性。同時(shí)，在統(tǒng)計(jì)分析中無(wú)論是細(xì)胞面積、厚度還是體積，實(shí)驗(yàn)組3數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差均最小，表明該接種量下離散程度最小，各項(xiàng)指標(biāo)具有更強(qiáng)的均一性。

2.2 登革病毒感染C6/36細(xì)胞的三維形態(tài)學(xué)變化

4×10⁵接種量下，C6/36細(xì)胞全息圖顯示單個(gè)細(xì)胞三維形態(tài)表現(xiàn)統(tǒng)一，細(xì)胞面積、厚度和體積離散程度均最小（P<0.05），確定其為最佳成像密度；轉(zhuǎn)移至37 ℃、5% CO₂培養(yǎng)24 h后細(xì)胞厚度、面積和體積改變無(wú)顯著性差異（P>0.05）；孵育和培養(yǎng)期間4個(gè)血清型DENV組

細(xì)胞面積和體積增大表現(xiàn)一致，但孵育期間DENV1-4均表現(xiàn)細(xì)胞厚度減小不同，培養(yǎng)期間DENV1、2細(xì)胞厚度減小而DENV3、4出現(xiàn)截然相反的厚度增大現(xiàn)象。同時(shí)，不同血清型間變化趨勢(shì)及程度具有各自特異性。

討論：

綜上，本研究建立了一種基于數(shù)字全息顯微技術(shù)的活細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)新方法，實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過(guò)三維全息圖、形態(tài)學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)等方式可以全面闡述細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的方向與強(qiáng)度。此方法應(yīng)用于登革病毒感染C6/36細(xì)胞的膜構(gòu)象改變的探索，有助于全面闡述感染過(guò)程中細(xì)胞系列膜構(gòu)象變化趨勢(shì)，為深入研究不同血清型登革病毒感染機(jī)制奠定基礎(chǔ)。