束縛應激所致小鼠腦區的神經遞質和行為改變及運動干預效果

摘要：為了探討束縛應激對小鼠神經遞質、行為的影響及有氧運動的干預效果。選用 1 月齡 C57BL/6 小鼠 80 只，隨機分為 4 組：控制組(Control，n=20 只)、束縛應激組(Stress，n=20 只)、運動組(Ex，n=20 只)、運動束縛應激組(Stress+Ex，n=20 只)。控制組安靜飼養，束縛應激組進行2 周的束縛應激，運動組每天進行 2 h 跑臺鍛煉，運動束縛應激組同時進行束縛應激和跑臺鍛煉。結果發現：行為試驗中，束縛應激組小鼠社交行為顯著下降、焦慮及抑郁行為水平發生顯著上升(P<0.05)，而運動干預能夠緩解束縛應激對這些行為的影響。生化指標同樣說明有氧鍛煉有效緩解了束縛應激導致的行為和單胺類神經遞質的改變。結果說明：束縛應激會導致社交及情緒相關行為的改變，而運動干預會起到有效的緩解作用。

關鍵詞：運動生理學；束縛應激；運動；社交行為；單受神經遞質；小鼠

持續壓力會造成人或者動物改變社交習慣、降低認知能力，甚至產生抑郁或者焦慮等情緒失調。因此，探索壓力應激對個體腦及行為塑造作用機制對保障人類身心健康具有重要意義。束縛應激是廣泛使用的模擬人類生活壓力應激的動物模型之一。束縛應激會影響動物的多種行為學和生物學指標，其中包括對學習和記憶等認知方面的損害、社交互動行為的改變。急性束縛應激會使機體產生負性情緒，造成腦部的海馬神經元損傷，樹突棘和增生物增加。慢性束縛應激因改變 HPA 軸的敏感性而造成行為的改變。大量研究發現，伴隨著大腦皮層、海馬及外周血中兒茶酚胺神經遞質及代謝物含量的改變，慢性束縛應激會顯著降低實驗動物的認知功能。束縛應激會造成神經內分泌改變，包括兒茶酚胺的降低及皮質酮應激反應敏感性下降。這種神經內分泌的改變與神經元中五羥色胺受體功能和表達的上升及五羥色胺神經遞質分泌的改變相關。慢性應激會使杏仁核中的神經元極度活躍，造成相對應神經元的損傷。而動物研究表明，運動可調節多種神經遞質系統，如五羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)及它們的代謝產物，進而會起到積極的干預作用。

雖然束縛應激對神經遞質及行為影響的研究多見報道，但是運動對慢性束縛應激干預效應和機制研究相對較少。因此，本研究用小鼠慢性束縛應激模型考察運動干預效果，探索其作用機制。

1  實驗材料和方法

1.1  試劑與儀器

1)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)購自美國 Sigma 公司，純度≥ 98.0％；乙腈：色譜純，采用美國 Fisher Scientific 公司產品；高氯酸、碳酸氫鉀、冰醋酸等均為分析純，南京化學試劑有限公司產品；實驗用水為自制二次重蒸水。

2)LC.10AD vp 高效液相色譜儀、SPD-10AD vp 熒光檢測器、色譜柱為島津 Shim-pack  VP-ODS 的 CTs液相色譜柱(150  ibm×4.6  mm×5  μm)(日本島津公司)；GL.88B 旋渦混合器(江蘇海門麒麟醫用儀器廠)；電恒溫水浴裝置(江蘇光都機電設備有限公司)；Supermaze動物行為分析系統、社交行為箱、高架十字迷宮、新物體識別箱、強迫游泳實驗箱(上海欣軟公司)。

1.2  實驗動物和實驗設計

C57BL/6 小鼠(3 周齡)購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠養在通風的隔籠里，室溫為 20~25 ℃，相對濕度 60%  ，光暗周期為 12  h，保持安靜，食物和水按時提供。在正式實驗前所有小鼠均預先適應 1 周并且每天都進行小鼠稱重。80 只小鼠隨機分成4 組，每組 20 只，控制組(n=20 只)，束縛應激組(n=20只)，運動組(n=20 只)，運動束縛應激組(n=20 只)。具體實施方案如下：適應性喂養 1 周，束縛應激為每天上午 10：00 開始持續 120 min，跑臺鍛煉時間為下午18:00 持續 30 min，每周訓練 5 d，共 2 周。束縛應激方法：取 50 m L 圓柱形離心管(管底留一個 3 mm 半徑小孔)，將小鼠放在只能容納小鼠整個軀體的管子中，將管子放在同一房間的不同籠子中，放置時間是上午09：00—11：00。跑臺鍛煉方法：進行平坡的跑臺運動，速度 0.8 km/h，坡度為 0°，實驗開始前 1 天下午18：00 對小鼠進行一次 15 min 的適應性訓練，然后第2 天按上述運動方案訓練。其中運動束縛應激組同時進行束縛應激和運動干預；束縛應激組只束縛應激；運動組只運動干預；控制組與其它組小鼠一起飼養，無運動干預和束縛應激。所有動物實驗均遵循東南大學倫理委員會指導文件操作。

1.3  指標檢測

1 月齡小鼠正處于青少年期，為了研究是否束縛應激會導致焦慮、抑郁以及社交行為的改變。在兩周實驗完成后，依次進行社交行為實驗，高架十字迷宮、新奇-抑制攝食試驗以及強迫游泳實驗來驗證小鼠的焦慮和抑郁水平及運動干預對小鼠這些行為的影響，行為實驗結束后，平衡 24 h 后處死并迅速檢測不同腦區單胺類神經遞質水平。

1)社交行為實驗。

社交行為實驗采用包含有3個相同大小的房間(40 cm×40 cm×20 cm)的社交行為觀察室，中間為空房間并有通向兩側房間的通道，兩側房間分別各放 1 個鼠籠。實驗小鼠分兩類，一類為社交行為專用陌生小鼠(stranger)，而另一類為實驗鼠。測試選用 2 只社交行為專用陌生小鼠 1 和 2，均為雄性，年齡、體重相近，同實驗小鼠品系相同且實驗前沒有接觸過的小鼠。 用不透明的樹脂玻璃板隔離左右側兩個房間。實驗開始前將實驗鼠放入行為觀察箱的中間房間適應 5 min，期間將陌生小鼠隨機放入一側房間的鼠籠中。實驗小鼠可以同陌生小鼠隔著鼠籠相互嗅探，但無法進行肢體接觸。正式實驗開始時移去隔離板，通過動物行為分析系統分別記錄10 min內實驗小鼠同空鼠籠或陌生小鼠的互動時間和房間逗留時間。互動時間=實驗小鼠直接接觸鼠籠+距 2 cm 內直立嗅探的時間。實驗小鼠在每個房間的逗留時間以每只小鼠頭和四肢均進入房間后為準。實驗結束后將實驗小鼠取出、歸籠。每次實驗后用體積分數為 70%酒精清潔整個測試裝置以備下一個實驗。具體過程見圖 1。

如圖 1 所示，籠中的為陌生小鼠，籠外的為實驗小鼠，社交行為實驗前后包括兩個階段：第 1 階段同時記錄(A)實驗小鼠在陌生小鼠 1 或空鼠籠所在房間的逗留時間和(B)實驗小鼠同空鼠籠或陌生小鼠 1 互動的時間；第 2 階段為(C)實驗小鼠在陌生小鼠 1 或陌生小鼠 2 所在房間的逗留時間和(D)實驗小鼠同陌生小鼠 1及陌生小鼠 2互動時間。

2)高架十字迷宮實驗。

將小鼠放在十字迷宮正中間，高度距離地面 1 m，兩邊為封閉臂，另兩邊為開放臂。用電子路徑系統記錄小鼠停留在開放臂和封閉臂的時間以及路徑。迷宮需用體積分數為 70%的乙醇和水清洗、干燥無味后進行下一只動物實驗。

3)新奇-抑制攝食試驗。

小鼠剝奪飲食一段時間后，分別放在新物體識別箱(60cm×60cm×30 cm)里。將1粒球狀鼠糧置于實驗箱底的中心，每只小鼠放于實驗箱底的角落，自由活動12min。記錄每只小鼠第1次吃到食物的時間，分別記錄測試結束后 30 min 內每只小鼠在籠中的飲食情況。

4)強迫游泳實驗。

將小鼠放在水桶的中心(水溫 24~25  ℃；水桶半徑 20 cm，高 40 cm) 10 min。小鼠無法接觸水桶的底部。小鼠的行為通過視頻路徑監控系統自動記錄。儀器自動記錄小鼠的潛在不動的時間及最后 4  min 的掙扎時間(四肢強烈掙扎、劃擦水桶壁)。

5)小鼠取材。

每只小鼠稱重后隨機分組，每周一下午 18：00鍛煉前，用電子天平(JZC-XXC，上海亞津科技有限公司)稱量各組小鼠體重。行為測試結束后靜置 24 h，斷頸椎處死，迅速剝離不同腦區并取血，腦組織樣品稱重，加入 50  μL 用冰預冷的 0.1  mol/L 高氯酸(含 10-7mol/L 維生素 C)用微量勻漿機勻漿，勻漿液再 5 200×g 離心(4℃) 30 min，然后用 0.22  μm 濾膜過濾并將 10 μL 濾液用 990  μL 蒸餾水稀釋到 1 m L，吸取 20  μL稀釋液注射到色譜儀進行分析，其他樣品迅速置于-80℃保存。

6)單胺類神經遞質及其代謝物檢測。

小鼠腦部的單胺神經遞質及其衍生物采用高效液相色譜熒光檢測法：采用 ESA MD-150 色譜柱(150 mm×3.2 mm，2.0 µm)，C18 預柱(10 mm×3 mm，3 µm)。激發波長為 345 nm，發射波長為 480 nm；流動相選擇：用 0.45  μm 的微孔濾膜過濾，超聲脫氣乙腈和 15 mmol/L 醋酸鹽緩沖液(p H4.7；35︰65，體積比)流速：1.0 m L/min，柱溫：30  ℃，進樣量：20  μL。

7)數據統計。

所有數據均錄入 SPSS18.1 統計軟件，并通過方差分析統計束縛應激以及運動干預的作用。

3  討論

束縛應激是模擬人類生活壓力改變人類社交、情緒及認知等多種行為最常見的動物模型。同時，束縛應激也是廣泛應用的應激障礙疾病動物模型，不但可以模擬免疫下降、認知功能下降，還可以使小鼠產生焦慮及抑郁等癥狀。越來越多的證據說明，束縛應激對腦具有塑造作用，這種塑造作用可以表現為基因、神經內分泌及行為學的改變。應激將單胺類遞質系統激活后，會對神經網絡結構產生影響，因此重復應激會使機體對應激產生適應。

在應激狀態下，實驗動物的腦內可出現 5-HT 更新速率增加，使 HPA 軸過度亢進或功能不足，進而導致 5-HT 濃度改變。急性應激使皮層、海馬，及杏仁核 5-HT 和其代謝產物 5-HIAA 的含量顯著增加；慢性應激皮層 5HT 及 5-HIAA 逐漸恢復到或低于應激前水平。大鼠在 3 h 急性運動后或 8 周跑臺運動后，大腦 5-HT 的水平都升高。微透析研究發現，60  min跑臺運動后，大鼠海馬的 5-HT 水平升高。另外，研究表明，大鼠興奮水平與腦內 DA 釋放成正相關，重復應激后動物海馬 DA 水平降低。運動使大鼠前額皮質、海馬和紋狀體的 DA 水平及其代謝物水平都有所增加。因此，之前的研究似乎表明海馬神經元與情緒的興奮、抑制平衡有關系。

在本研究中，對應激組被試小鼠不同腦區中單胺類遞質檢測發現，5-HT、DA 及 NE 在大部分腦區中含量均有所降低，部分結果與之前的研究結果相一致，說明束縛應激是易復制的應激動物模型。第 1，本研究證明了束縛應激可以使小鼠焦慮和抑郁行為增加；第 2，本研究的結果同樣發現束縛應激降低了小鼠社交行為；最后，本研究發現束縛應激使小鼠不同腦區大多數單胺類神經遞質水平下降。總的來說，本研究結果與之前束縛應激小鼠模型結果相一致，證明本束縛應激模型成功復制模擬壓力影響個體行為傾向性的模型。

同時，本研究發現小鼠束縛應激后會出現社交互動行為下降、焦慮及抑郁水平增加的情況。這些行為的改變可能與不同腦區抑制性與興奮性單胺類神經遞質失調相關。更重要的是，運動干預可以緩解束縛應激后的焦慮抑郁相關行為、單胺類神經遞質及其代謝物水平的改變。這些結果說明周期為 2 周、每天 2 h 的慢性束縛應激可能會使小鼠產生適度的焦慮抑郁行為，而運動干預卻降低了束縛應激產生的這種變化。

大量研究證明運動可以用來緩解壓力造成的負性情緒及行為，提高認知功能。在前期研究的基礎上，本研究用運動干預的方法來緩解壓力造成的焦慮、抑郁及社交相關行為的改變。本研究結果說明運動緩解了應激造成的多種行為學及生物學的變化。部分結果與之前的相關研究結果不一致，有待進一步深入研究。