2. 將標本放在卡片的一端。標記該卡片，將帶有標本的一端浸入液氮中。60s后，取出標本并放在干冰上。修剪卡片，使其大小剛好比組織塊稍大些，轉入預冷的(-70℃)帶有標記的小瓶中。

3. 切片前，用1％明膠包被潔凈的載玻片。加熱至50℃使明膠溶于水中，冷卻，加入0.02％疊氮鈉。將玻片浸入明膠溶液中30s，取出，自然干燥。

4. 按照儀器使用說明書，用低溫恒溫器制備冷凍切片。通常切片厚度在5-10gm之間。用包被過的載玻片收集切片。

5. 讓切片自然干燥。浸入新鮮配制的4％多聚甲醛中2min。

6. 用PBS洗數次，放入含1％NP-40的PBS中5rain。用PBS洗數次。

7. 將帶有組織切片的載玻片放在濕盒中。加合適稀釋度的一抗，用含蛋白質的溶液如3％BSA／PBS稀釋抗體。

單克隆抗體最好選用雜交瘤細胞培養上清(特異性抗體濃度為20-50gg／m1)。小鼠腹水、純化的單克隆抗體和多克隆抗體，以及粗制的多克隆抗血清應該測試其稀釋度，以使特異性抗體的濃度在0.1～10ug／m1之間。如果特異性抗體的濃度是未知的，則制備并測試初始制品的不同稀釋度(1：10，1：100，1：1000和1：10 000)。

8. 將玻片置濕盒中于室溫下孵育至少60min。對于某些反應來說，孵育時間可延長至24h，以增加其敏感性。

9. 用PBS洗3次，每次5min以上。

10. 加辣根過氧化物酶標記的二抗(特異性針對一抗)。這些試劑可以購自不同的經銷商。如果二抗的確切用量是未知的，測試1：50—1：1000稀釋的二抗。用含蛋白質的PBS稀釋，如3％BSA／PBS。

11. 將樣本置濕盒中，于室溫下孵育30min。

12. 用PBS洗3次，每次5min以上。

13. 配制DAB／金屬鹽試劑。將6mg DAB溶于9ml 0.05mol／L Tris緩沖液(pH7.6)中。加lm[0.3％(W／V)氯化鎳貯存液(可用相同濃度的氯化鈷代替)。加0.1ml 3％過氧化氫。如果出現沉淀，用Whatman 1＃濾紙(或相似品)過濾。

14. 將上述溶液加到標本中。在低倍光學顯微鏡下觀察。當形成足夠的棕／黑色沉淀時，用水沖洗以終止反應。通常這一反應過程約需1-20min。

15. 加數滴Harris蘇木精。孵育約5min。時間長短取決于染色的強度。

16. 用水輕柔沖洗。

17. 通過各級乙醇使標本依次脫水。在75％乙醇中孵育兩次，每次3min，95％乙醇中2次，每次3min，100％乙醇中2次，每次3min。自然干燥。