一、實(shí)驗(yàn)步驟

五、結(jié)果

圖3：細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

一、 取14.5d SD大鼠一只。

二、 苯巴比妥0.5 ml 腹腔注射，待麻醉后置于手術(shù)臺(tái)上，酒精棉球消毒皮膚，開(kāi)腹取出子宮（約12-14個(gè)），放入解剖液中，剖開(kāi)子宮，取出胚胎，放入解剖液中，在耳眼之間離斷，取頭側(cè)部組織，去除腦膜組織，取原始中腦區(qū)組織，放入離心管裝的解剖液中，待全部取出后，1500轉(zhuǎn)2分鐘。

三、 用吸管吸出上清液，在組織細(xì)胞沉淀中加入胰蛋白酶一管（1 ml/vial），室溫30分鐘，1500轉(zhuǎn)，離心5分鐘（離心前可加入解剖液以終止胰酶作用）。

四、吸去上清，在組織細(xì)胞沉淀中加入Dnase 一管（2 ml/vial），37℃反應(yīng)10分鐘，1500轉(zhuǎn)，離心5分鐘，吸去上清，在組織細(xì)胞沉淀中加入2 ml DM培養(yǎng)液吹打，計(jì)數(shù)（計(jì)數(shù)公式為（N1+N2+N3+N4）/4*10 _⁴），以3*10⁵個(gè)/瓶在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，做好標(biāo)記（時(shí)間、原代還是第幾代傳代，姓名，細(xì)胞名稱(chēng)等），放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

一、分離大鼠胚胎（16-18周）新皮層，置于L-15（或Hank’s平衡鹽/DMEM溶液，無(wú)Hepes）培養(yǎng)基中，除去腦膜和血管、海馬、尾核和其他非皮層組織。

二、 用解剖刀將其切成1 mm³大小的組織塊。

三、用1ml槍頭轉(zhuǎn)移250 μl膠原酶儲(chǔ)存液（1.33%，溶于L-15中）到1ml的L-15（或D-MEM）中。每2只鼠腦組織塊使用1-1.5 ml稀釋膠原酶液。

四、37℃水浴中孵育30 min。

五、1 000 rpm(大約230g)中離心5 min，或3 000 rpm(大約2 000 g)中離心1 min。

六、去上清。

七、在含EDTA-CMF的溶液中重懸細(xì)胞，并與胰蛋白酶以1：4～1：10比例混合。可以根據(jù)觀察到的細(xì)胞消化的情況，適當(dāng)調(diào)整兩者的比例。

八、加入胰蛋白酶的抑制劑和DNase溶液，混合5分鐘。

九、1 000 rpm(大約230 g)中離心5 min，或3 000 rpm(大約2 000 g)中離心1 min。

十、去上清。加入500 μl D-MEM-BS。

十一、輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，開(kāi)始用5 ml槍頭吹打10次，在需要時(shí)用18-gauge的針頭吹打。( 注意：不要產(chǎn)生氣泡。）200目/300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾。

十二、將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含10%FCS-DMEM的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)密度為2X10⁶/25 cm²培養(yǎng)瓶，4～6 X10⁶/75 cm³培養(yǎng)瓶。在37.2℃，37.5%中培養(yǎng)。

十三、第2天換液，以后每隔3天換液。

十四、7-10天，細(xì)胞發(fā)生融合。

十五、細(xì)胞融合后，將瓶蓋用封口膜密封好，在軌跡搖床上培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)速度以不產(chǎn)生氣泡為宜。37℃振搖過(guò)夜。細(xì)胞注意避光。

十六、去上清，加入新鮮10%FCS-DMEM。

十七、加入200 μl 1 mM的阿糖胞苷/10 ml培養(yǎng)基。在37.2℃，37.5%中培養(yǎng)孵育48小時(shí)以消除分裂的細(xì)胞。

十八、換用新鮮10%FCS-DMEM，孵育恢復(fù)24小時(shí)。

十九、重復(fù)17-18步驟，消除所有的分裂細(xì)胞