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細胞技術專題:大鼠主動脈內皮細胞培養實驗

瀏覽次數:1058 發布日期:2014-2-18  來源:上海北諾生物科技有限公司

大鼠血管內皮細胞培養可以:(1)用于血液流動性、防止血栓形成、調節血管張力等研究;(2)用于選擇性通透性以及免疫調節等方面研究。

實驗方法
  • 貼塊法
實驗方法原理
貼塊法適用于內皮細胞產量低的、管徑較小血管的內皮細胞培養,其方法較酶消化法簡便、經濟。但缺點使易混有成纖維細胞和平滑肌細胞,前者的貼壁時間和內皮接近,后者貼壁較內皮慢,而且會被肝素所抑制。
實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟
一、實驗方法
1. 頸椎脫臼處死大鼠,將整個大鼠浸泡于75%乙醇中消毒約1  min。在無菌狀態下,逐層剪開胸腔,分離取出主動脈,放含無菌 D-Hanks’液培養皿中。

2. 用眼科剪、鑷盡量去除血管外膜的脂肪和纖維組織。然后,用含抗生素的D-Hanks’液沖洗血管的外表面及血管腔內的凝血數次,再放入另一無菌培養皿中。

3. 用眼科剪縱向剪開血管,平展在培養皿中。用非常銳利的手術刀將其切成1 mm大小的動脈植 塊(或者用剪刀剪,依照個人習慣),然后種植到培養瓶或培養皿(培養瓶或皿用1%明膠預置 37℃下過夜, 使用前2  h 移入CO2培養箱中。用時可以先經含 10%小牛血清的培養液沖洗)。將動脈植塊的內膜面與瓶底接觸,種植密度約為 1 塊/cm。

4. 置培養箱中靜置2 h(干貼壁)。然后,加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培養液,液量以略蓋過動脈植塊內膜面,而又不使植塊漂浮為宜。24 h 后,更換培養液,加入 2-3 ml 培養液。

5. 72 h 左右的時候,當觀察到內皮細胞充分長出,而成纖維細胞剛要長出的時候,將動脈植塊除去,刮除成纖維細胞,換培養液1 次。以后每2 天換液一次,每次換1/2~1/3 的液量。繼續培養 8-10 d, 細胞融合成單層,即可傳代。

二、實驗結果

植塊培養法進行的原代培養,一般在培養2-3 天,動脈植塊周圍即有細胞生長,并漸向外延伸,呈扁平短梭形或多角形;約8-10 d 后細胞融合成片。采用vWF 免疫組化鑒定,主要表達在細胞漿中。
收起 
其他
一、實驗討論
 
植塊培養法適用于內皮細胞產量低的、管徑較小血管的內皮細胞培養,其方法較酶消化法簡便、經濟。但缺點使易混有成纖維細胞和平滑肌細胞,前者的貼壁時間和內皮接近,后者貼壁較內皮慢,而且會被肝素所抑制。
 
而由于成纖維細胞生長較快,隨著傳代次數越多,其污染的程度越重,從而使培養失敗。因而,抑制和減少成纖維細胞是大鼠主動脈內皮細胞培養的關鍵問題。本法采用的方法是:
   
1. 在合適的時間去除動脈塊,即當內皮細胞已經爬出,初具規模時(大概在72 h 左右的時候,按照本文的培養液條件,因為有生長因子,內皮容易爬出和增殖),去除動脈塊,并刮除成纖維細胞。

2. 使用含肝素的培養液(在培養液中加入100 U/ml 的肝素),可使內皮細胞純度提高;
   
3. 高濃度的血清和50 µg/ml ECGF 可以充分地促進內皮細胞增殖,而使內皮細胞成為優勢細胞。另外,動脈植塊干貼壁的時間不宜超過2 h,而加培養液這一步驟尤為關鍵,過少會使內膜接觸不到培養液,過多則易使動脈小塊漂浮,導致貼壁失敗。因此,干貼壁后加培養液,加入少量高營養的培養液(0.5-1 ml),可以避免這些問題。
   
組織塊貼塊的時候,不可避免會有一些塊貼的方向不是內膜面,那么最后將爬不出內皮,甚至長出較多雜質細胞,需刮除。
   
另外,部分塊即使大小合適,方向也正確,也可能爬不出來,去除組織塊的時候,應該以大局為重,看到內皮細胞已經爬出較多,而雜質細胞也開始爬出的時候,就要果斷地去除組織塊了。72 h 只是個大概的時間,初學者不可以拘泥。
發布者:上海北諾生物科技有限公司
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