高效液相色譜（High Rerformance Liquid Chromatography, HPLC）又叫高壓、高速、近代液相色譜，通常叫做高效液相色譜。它是60年代中期才建立的一種高效快速分離化合物的方法，到了70年代后期才廣泛用于蛋白質(zhì)的分離純化方面，現(xiàn)已成為分離純化蛋白質(zhì)非常有效的方法之一。

和經(jīng)典常壓色譜相比它有以下特點：
1、HPLC分離、純化蛋白質(zhì)的速度快。通常半小時左右可進行一次，大大縮短了純化蛋白質(zhì)的時間；
2、分辯率高。一根長10cm的色譜柱可分離十幾種以上的物質(zhì)；
3、適應面廣，靈活性強，幾乎所有的蛋白質(zhì)根據(jù)它們的性質(zhì)差別（等電點、疏水性、分子量、電荷分布等）都可以用不同HPLC方法進行分離提純；
4、靈敏度高。HPLC現(xiàn)已廣泛采用多種高靈敏度的檢測器，如紫外、熒光、電導等。熒光的靈敏度可達10-9g；
5、重復性好，在作分析蛋白質(zhì)分析試驗時，誤差一般不超過5%。
因此，HPLC在蛋白質(zhì)分離純化方面具有極其重要的位置。

 

當然HPLC也有它的缺點，例如，儀器設(shè)備價格昂貴，雖然已有制備柱使用，但制備量還是受到限制，在某些方法中，由于使用有機溶劑，對蛋白質(zhì)的活性會有一定影響。

 

高效液相色譜儀是高效液相色譜的專用儀器，有很多種類，從類型看分為綜合型高效液相色譜儀和專用型儀器，從功能上分為分析型、制備型、分析和制備兼用型。

一般高效液相色譜儀主要有以下部分組成：

1、輸液泵，為色譜柱輸送液體；
2、進樣器；
3、色譜柱，對樣品進行分離；
4、檢測器，對分離后樣品進行檢測；
5、記錄器（數(shù)據(jù)處理和打印部分），對檢測到的信號進行處理和記錄；
6、程序控制器，對各部分進行程序控制，例如輸入色譜條件、參數(shù)等。另外，常配有貯液裝置、脫氣裝置、分部收集器等。

 

根據(jù)分離模式的不同，高效液相色譜通常分為以下幾種模式：
1、高效排阻液相色譜，按蛋白、多肽分子量大小進行分離；
2、高效離子交換液相色譜，按蛋白質(zhì)、多肽帶電不同而進行分離；
3、高效反相液相色譜，按蛋白質(zhì)、多肽的疏水性不同而進行分離；
4、高效疏水作用液相色譜，其原理與反相色譜相同。區(qū)別在于疏水色譜的填料表面疏水性沒有反相介質(zhì)的強；
5、高效親合液相色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性吸附而進行選擇性分離的一種生物大分子分離方法。

 

 

又叫體積排阻色譜（Size exclusion chromatography, SEC），分子篩色譜（molecular sieve chromatography），凝膠過濾（gel filtration）等，生化界常用凝膠過濾。SEC是一種純粹按照溶質(zhì)分子在流動相溶劑中的體積大小分離的色譜法，填料具有一定范圍的孔尺寸，大分子進不去而先流出色譜柱，小分子后流出。用于生物大分子分離的傳統(tǒng)SEC填料主要是多糖聚合物軟膠，只能在低壓下作慢速分離用。目前在很大程度上被微粒型交聯(lián)的親水凝膠（如交聯(lián)瓊脂糖Superose6和12），乙烯共聚物（如TSK-Gel PW）和親水性鍵合硅膠（如Zorbax GF 250和450）所取代。隨所用填料的孔徑大小不同，SEC能分離的分子量級分范圍在1萬到200萬之間。對于分析分離或?qū)嶒炇倚∫?guī)模制備，平均粒度在3-13微米的規(guī)格較適用，有良好的柱效率和分離能力。但對大規(guī)模的制備分離和純化，因要考慮成本和滲透性，可以采用較粗的粒度。HPSEC的負載量較低，分析型HPSEC負載量在10-500μg之間，體積負載為柱總體積的1-2%。

 

HPSEC除用于蛋白質(zhì)分離外，還用在未知物分子量測定和純度鑒定上。它比SDS-PAGE電泳測定速度快，而且對于由亞基組成的蛋白質(zhì)，其測定值為天然分子量。也可以用于定量分析，誤差小于5%。

 

（一）實驗目的
檢測nrhTNF
 

1，高效液相色譜儀，Beckman Gold System系統(tǒng)

2，色譜柱：TSK-GEL G2000SW，日本曹達（TOSOH） 7.5×300mm

3，0.1mol/L PB-0.1mol/L NaCl pH6.8
 

流動相  0.1mol/L PB-0.1mol/L NaCl pH6.8

檢測波長  280nm

進樣量  20μl

流速  0.5ml/min
 

（四）樣品準備  
經(jīng)Q-Sepharose FF和SP-Sepharose FF純化的nrhTNF

1，緩沖液除氣：可采用超聲除氣；微波除氣；抽濾除氣

2，開機

3，輸入?yún)��?shù)

4，平衡色譜柱

5，進樣

6，洗脫

7，停止實驗，打印和分析結(jié)果

8，洗柱和保存
 

1，保留時間

2，峰型及純度（歸一化法）

3，計算含量
 

尺寸排阻色譜（SEC,Size Exclusive Chromatography）是液相色譜的一個分支，其分離過程是根據(jù)被分析物質(zhì)的分子體積（或分子量）大小，按順序被洗脫出色譜柱，以達到復雜混合物的分離目的。尺寸排阻色譜是分析大分子化合物的重要手段之一，因為分子量和分子量的分布是化合物的最基本和最重要的參數(shù)。根據(jù)待分離樣品的性質(zhì)，尺寸排阻色譜又分為適合于分離水溶性樣品的凝膠過濾色譜（GFC,Gel Filtration Chromatography）,以及適合于分離油溶性樣品的凝膠滲透色譜（GPC,Gel Permeation Chromatography）。

 

TSK-FEL SW系列色譜柱的填料是以剛性的球型硅膠為基質(zhì)，在其表面通過化學共價鍵鍵合上親水化合物而成。TSK-GEL SW系列色譜柱的填料具有高性能尺寸排阻色譜所必需的性能，即低吸附性和良好的孔徑分布；其pH適用范圍為2.5-7.5，可以使用與水完全互溶的有機溶劑，如乙腈、丙酮、甲醇或乙醇等。TSK-GEL SW系列色譜柱適合用于分析分離蛋白質(zhì)和多肽類樣品，其他應用有大量的文獻報道。最經(jīng)常使用的是10μm的TSKgel 4000SW色譜柱；TSK-Gel2000SWXL和3000SWXL是5μm，TSK-Gel 4000SWXL是8μm的高效填料色譜柱；分析型色譜柱的結(jié)構(gòu)可以是玻璃或不銹鋼材質(zhì)。