PCR技術(shù)專題：差示反轉(zhuǎn)錄PCR實驗
差示反轉(zhuǎn)錄PCR也稱為mRNA差異顯示技術(shù)，它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術(shù)，具有簡便、靈敏、RNA用量少、效率高、可同時檢測兩種或兩種以上經(jīng)不同處理或處于不同發(fā)育階段的樣品，該方法自問世以來已被廣泛用于差異表達基因的克隆鑒定研究中。
實驗方法
- mRNA差異顯示法
- 熒光標記法
| 實驗方法原理 | 幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都帶有一個多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu)，即通常所說的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA為模板，以oligo(dT)為引物合成出cDNA拷貝。根據(jù)mRNA分子3’-末端序列末端結(jié)構(gòu)的分析可以看到，在這段poly(A)序列起點堿基之前的一個堿基，除了為A的情況之外，只能有C、G、T三種可能。根據(jù)這種序列結(jié)構(gòu)特征，P.Peng等人設(shè)計合成三中不同的下游引物，它由11個或12個連續(xù)的脫氧核苷酸加上一個3’-末端錨定脫氧核苷酸組成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，這樣每一種此類人工合成的寡核苷酸引物都將能夠把總mRNA群體的1/3分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。于是，采用這三種引物，可以將整個mRNA群體在cDNA水平上分成三個亞群體。然后用一個上游的隨機引物和與反轉(zhuǎn)錄時相同的oligo(dT)引物對這個cDNA亞群體進行PCR擴增，因為這個上游的引物將隨機結(jié)合在cDNA上 ,因此來自不同mRNA的擴增產(chǎn)物的大小是不同的，可以在測序膠上明顯分辨開來，從而篩選出不同樣品間基因差異表達的DNA片段。 |
|---|---|
| 實驗材料 |
紅豆杉細胞 |
| 試劑、試劑盒 |
甲叉 SuperscriptTMⅡ試劑 檸檬酸鈉 Taq DNA聚合酶 dNTPs 十二烷基肌氨酸鈉 巰基乙醇 RNAimage試劑盒 異硫氰酸胍 焦碳酸二乙酯 |
| 儀器、耗材 |
基因擴增儀 凝膠成像系統(tǒng) 超低溫冰箱 電熱鼓風干燥箱 超凈臺 脫色搖床 核酸定量儀 多用電泳儀 DNA序列分析電泳槽 |
| 實驗步驟 |
一、實驗材料
1. 紅豆杉細胞
未經(jīng)MJ誘導處理的A和經(jīng)MJ誘導處理的B紅豆杉細胞。
2. 寡核苷酸引物
（1）3’錨定引物：
①H-T11A(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’
②H-T11C(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’
③H-T11G(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’
（2）5’ 隨機引物：
Kit引物：
①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTGATTGCC-3’
②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCGACTGT-3’
③H-AP3(2uM)： 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’
④H-AP4(2uM)： 5’-AAGCTTCTCAACG-3’
⑤H-AP5(2uM)： 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’
⑥H-AP6(2uM)： 5’-AAGCTTGCACCAT-3’
⑦H-AP7(2uM)： 5’-AAGCTTAACGAGG-3’
⑧H-AP8(2uM)： 5’-AAGCTTTTACCGC-3’
生工引物：
①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTCATTCCG-3’
②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCCACGTA-3’
③H-AP3(2uM)： 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’
④H-AP4(2uM)： 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’
⑤H-AP5(2uM)： 5’-AAGCTTCGGCATA-3’
⑥H-AP6(2uM)： 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’
⑦H-AP7(2uM)： 5’-AAGCTTACGCAAC-3’
⑧H-AP8(2uM)： 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’
特異引物：
①5ac： 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’
②ck5： 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’
③10ac： 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’
④10acb： 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’
⑤2ben： 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’
⑥3ben：5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’
⑦Phen：5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’
二、 實驗方法
2. 總RNA的提取與檢測
（1）用品的準備
塑料器皿，如離心管、Tip頭等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小時以上，高壓滅菌并烘干后使用；所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小時以上，高壓滅菌后4℃保存；玻璃器皿經(jīng)180℃烘烤12小時以上，冷卻備用。
（2）試劑的配置
① CSB緩沖液
42 mmol/L 檸檬酸鈉（Sodum citrate）
0.83%（W/V）十二烷基肌氨酸鈉（N-lauryl sarcosine）
0.2 mmol/L 巰基乙醇（β-mercaptoethanol）（使用前加入）
（3）RNA提取
對懸浮培養(yǎng)細胞A、B進行RNA提取，提取步驟如下：
① 50 ml 離心管中加入10 ml 變性勻漿液，冰浴5分鐘。
② 取0.5 g 細胞在液氮中研磨至粉末，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的變性勻漿液中，加200 ul β-巰基乙醇，振蕩混勻。
③迅速加入1 ml 2 mol/L 乙酸鈉（pH4.0），充分混合。
④ 加入10 ml 水飽和酚，劇烈振蕩10~15秒，在冰上放置5分鐘。
⑤ 加入2 ml 氯仿：異戊醇（24：1），劇烈振蕩10~15秒，在冰上放置15分鐘。
⑥ 4℃，12 000 g，離心20分鐘。
⑦ 小心移取上層水相，棄去中間相和下層有機相。
⑧ 加入6 ml 水飽和酚，劇烈振蕩10~15秒，在冰上放置5分鐘。
⑨ 加入6 ml 氯仿：異戊醇（24：1），劇烈振蕩10~15秒，在冰上放置15分鐘 |
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