響應面法優化隱甲藻產DHA的培養基

梅志剛^1[1]，王菊芳^2，*[2]

（華南理工大學  生物科學與工程學院  廣東  廣州  510006）

摘要：利用響應面法優化隱甲藻產DHA的培養基，在8種因素的單因素實驗基礎上，采用Plackett-Burman設計篩選出葡萄糖和胰蛋白粉為顯著影響因子，維持其它組分濃度在低水平不變，對以上兩因子爬坡逼近最大響應區域后利用中心組合設計和響應面分析得到最高點和主要因子的濃度。優化后的培養基組成為：葡萄糖30.54g/L, 胰蛋白粉5.03g/L，酵母粉4g/L，甘油20g/L，不添加MgCl₂和維生素溶液，其他組分同460培養基，在此培養基條件下，DHA產量達到907.54±1.02mg/L，是優化前產量的2.48倍。

關鍵字：隱甲藻，DHA，響應面

 

Response surface method for optimization of medium composition of Crypthecodinium.cohnii for DHA production

MEI Zhi-gang¹, WANG Ju-fang^2,*

Abstract: On the basis of single-factor experiments, eight factors were selected for response surface method for optimization of medium composition of Crypthecodinium cohnii. The results showed that glucose and tryptone were the significant factors by using Plackett-Burman design and other components were kept at the low concentration. Then the steepest ascent experiment was designed for the significant factors (glucose and tryptone) to reach the largest region, highest point and the concentrations of those significant factors were obtained by central composite experiments and response surface analysis. The optimized medium were as follows: glucose 30.54g/L, tryptone 5.03g/L,yeast 4g/L，glycerin 20g/L,without MgCl₂ and Vitamin solution, other components are the same with the 460 medium. After medium optimization, the DHA productivity was 907.54±1.02mg/L, as much as 2.48 times of that in primary medium.

Key words: crypthecodinium.cohnii; DHA; response surface

 

DHA(docosahexaenoic acid)是一種ω-3系列多不飽和脂肪酸，具有增強記憶，提高智力,降低血脂，調節免疫系統等功效，已經應用于臨床和流行病學和食品添加劑^[1,4]。20世紀80年代發現，隱甲藻具有較高的產DHA能力^[2]，脂肪酸積累量高于20%，DHA含量占總脂肪酸的30%~50%，是一種高效的DHA生產菌^[2,3]，來源于隱甲藻的DHA克服了傳統魚油DHA所帶有的魚腥味、富含EPA、成本高等缺點^[6]，美國哥倫比亞Mertek公司已用該菌種實現了規�；�生產。

 

雖然目前微藻生產DHA已工業化，但生物量和DHA的產量都相對較低^[3]，人們試圖用多種方法去提高DHA產量，有優化光照條件，添加氧載體，尋找優良培養基成分，改造油脂性能等^[4]如何實現隱甲藻的高密度發酵是DHA生產的關鍵，各種培養基對隱甲藻培養產DHA影響較大，培養基優化是必要的^[4,5]。

 

發酵培養基是多成分，而且成分之間可能相互影響，單靠單因素和正交試驗很難很快得到較好較嚴密的結果。單因素，Plackett-Burman，最陡爬坡，中心組合設計和響應面分析的依次設計是建立在多因素，多水平基礎上，突出重要因子，步步逼近最大響應區，分析任何因子的一次項，平方項和任何兩個因子間的一級交叉作用項的數學模型，近年來在培養基優化上使用很廣。本文采取了用響應面的方法對培養基優化，以期提高隱甲藻的生物量并提高DHA產量。

 

 

1.1藻種：Crypthecodinium. cohnii ATCC 30556 由中國熱帶農業科學院熱帶生物研究所提供。

 

1.2培養基： 460（A₂E₆） 培養基(L^-1)如下：NaCl 23.48g，MgCl₂·6H₂O 10.63g，CaCl₂1.11g，Na₂SO₄3.92g，KCl 0.66g，NaHCO₃ 0.19g，H₃BO₃ 0.03g，SrCl₂·6H₂O 0.04g，Metal Mixture 3.0ml，FeCl₃·6H₂O 0.01g，甘油磷酸鈉0.15g，Tris Buffer 3.0g，Vitamin solution 1.0ml，K₂HPO₄ 0.01g，Glucose 3.0g，甘氨酸1.5g。其中Metal Mixture如下：EDTA1.0g，FeCl₃·6H₂O 0.05g，H₃BO₃ 1.0g，MnCl₂·6H₂O 0.15g，ZnCl₂ 0.01g，CoCl₂·6H₂O 0.005g，H₂O 100mL。Vitamin solution如下：Biotin 0.003g，Thiamine 1g，H₂O 1L。

 

 

1.3.1菌種活化，培養及收集：取4℃保藏的菌種10%接入裝液量5mL試管，25℃，150r/min培養兩天后5%接種量轉接到裝液量10mL的搖瓶，25℃，150r/min培養兩天作為實驗的種子液。種子液以5%接種量接入裝液量50mL的250mL搖瓶，25℃，150r/min培養5天收集菌體。10000r/min離心10min,蒸餾水清洗3次。-40℃，0.317帕，凍干稱量至恒重。

 

1.3.2 脂肪酸提取：改進的Bligh--Dyer法^[9,10]。

 

1.3.3脂肪酸甲脂化^[13]

 

1.3.3色譜檢測條件：采用Agilent 7890A氣相色譜儀，FID檢測器，19091N-113 HP-INNOWAX毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm)；載氣為N₂，進樣口溫度250℃，檢測器溫度300℃。程序升溫，130℃保溫1 min，以5℃/min升溫到250℃保溫8 min，總運行時間33.00 min。

 

1.3.4計算方法^[11]：每個點做三次平行取平均值，數據處理和實驗設計分別在Excel和Minitab輔助下完成

 

1.4單因素實驗^[7]：以460medium為基礎，外加甘油，酵母粉，胰蛋白粉，乙醇，研究其中含量較多和重要的8種成分，為PB實驗設計作參考。

 

在單因素實驗基礎上，選取對DHA產量影響較大的8個因素，進行12次的Packett-Burman設計實驗，篩選出重要影響因子。

 

對篩選出的因子根據方程進行最陡爬坡設計，以坡的最高點作為后續中心組合的中心點。

 

根據Box-Behnken的中心組合原理，設計合適的水平，中心點重復多次，用Minitab軟件分析，對得到的理論最高點做3次重復驗證。

 

 

對葡萄糖，甘油，乙醇，胰蛋白粉，酵母粉，氯化鈉，氯化鎂，維生素溶液8因子進行單因素實驗。結果表明以上組分濃度分別為30(g/L)，20(g/L)，5(g/L)，5(g/L)，5(ml/L)，24g/L，10.4g/L，1ml/L時DHA產量分別達到最高為： 521.3±1.12(mg/L)，626.24±1.02(mg/L)，709.54±1.02(mg/L)，759.07±1.12(mg/L)， 812.78±1.12(mg/L)，835.32±0.98(mg/L)，855.77±1.02(mg/L)，860.12±1.00(mg/L)。依此為Packett-Burman設計合理的濃度水平，其中原始460培養基DHA產量365.48±1.12(mg/L)。

 

通過單因素實驗，所選8因子對菌體量和DHA產量都較大影響，利用PB兩水平對培養基8種成分進行考察，篩選重要因子，確定最佳方案，實驗設計見表1。

 

表1　PB試驗因素與水平

	A(g/L)	B(g/L)	C(g/L)	D(g/L)	E(ml/L)	F(g/L)	G(g/L)	H(ml/L)
	葡萄糖	甘油	酵母粉	胰蛋白粉	乙醇	氯化鈉	六水氯化鎂	Vitamin
-1	20	20	4	4	4	24	10.4	1
1	25	25	5	5	5	30	13	1.25

 

Packett-Burman實驗結果見表2，用Minitab軟件分析PB實驗見表3，在99%置信區間下，A(葡萄糖)和D（胰蛋白粉）為影響顯著因子。同時得到一次回歸模型方程：Y= 851.236 +11.049A+ 6.306B+5.993C+17.99D-2.23E -6.269F -1.051G +0.289H （1），復相關系數R²=99.16%，擬合很好，8個因子對響應值的影響大小依次是：胰蛋白粉＞葡萄糖＞甘油＞氯化鈉＞酵母粉＞乙醇＞氯化鎂＞維生素溶液。

 

表2　PB試驗方案與結果

 

表3　因素影響效果分析

       *”表示在99%置信區間內顯著

 

根據PB實驗可知，除了A(葡萄糖)和D（胰蛋白粉）以外，其他因子在99%的置信區間內DHA產量沒有顯著影響，E（乙醇），G（六水氯化鎂），H（維生素溶液）效應值非常小，可以不加，所以維持其他組分保持低水平，對A(葡萄糖)和D（胰蛋白粉）進行最陡爬坡。由表4可知，最優條件在第五處理附近，因此以A(葡萄糖)濃度30g/l，D（胰蛋白粉）濃度5.0g/l作為后續響應面實驗的中心點。  

 

表4  最陡爬坡實驗設計和結果

處理	A	D	DHA(mg/L)
1	22	4.2	850.30±1.12
2	24	4.4	855.92±1.20
3	26	4.6	859.01±0.90
4	28	4.8	882.53±1.02
5	30	5.0	895.14±1.58
6	32	5.2	890.76±1.01
7	34	5.4	885.60±1.03
8	36	5.6	870.46±1.08
9	38	5.8	848.72±1.06
10	40	6.0	814.23±1.01

 

根據爬坡試驗得到的中心點,對A和B進行中心試驗組合設計。為使擬合方程具有旋轉性和通用性,中心點重復5次，星號臂長γ= 1.414。自變量水平及編碼見表5，試驗設計及結果見表6 。        

             

表5  中心組合實驗的變量和水平

因子（g/L）	水平
	-1.414	-1	0	1	1.414
A(葡萄糖)	27.2	28	30	32	32.8
D（胰蛋白粉）	4.78	4.8	5	5.2	5.52

 

表6　中心組合試驗設計及試驗結果

 

　                圖1 響應面分析法(A,D)立體分析圖A和相應的等高線圖B

 

通過Minitab軟件分析，各個因子的的偏回歸系數估計值及方差分析結果見表7

 

表7　回歸方程中回歸系數的估計值及方差分析

項	系數	T	P
常量	907.003	1632.109	＜0.0001*
A	5.352	12.182	＜0.0001*
D	2.977	6.776	0.0003*
A*A	-9.258	-19.650	＜0.0001*
D*D	-6.439	-13.666	＜0.0001*
A*D	-3.291	-5.297	0.0011*

              *”表示在99%置信區間內顯著

 

由此表可得到擬合的全變量編碼水平的二次回歸方程為:

Y=907.003+5.352A+2.997D-9.258A²-6.439D²-3.291A*D  （2）

該模型方程相關系數R²=0.9906，擬合很好。二次項,一次項和交叉項都影響顯著。二次項系數為負，說明拋物面開口向下，有最大值。為了更直觀地描述兩因子對響應值的影響，做出模型（2）的等高線和曲面圖（圖1）。由此確定的A(葡萄糖)和D(胰蛋白粉)最佳濃度為30.54g/L和5.03g/L，DHA產量最大907.94mg/L。為了證實預測值和真實值之間的擬合程度，以預測濃度再做三次重復驗證，生物量和DHA平均值為8.91±0.11g/L，907.54 ±1.02 mg/L擬合良好。從而確定最佳培養基的組成為30.54g/L，甘油20g/L，胰蛋白粉5.03 g/L，酵母粉4 g/L，不添加氯化鎂和維生素，其他組分濃度同460培養基。

 

 

1原始的460培養基隱甲藻的生物量和DHA產量分別是3.32±0.12（g/L），365.48±1.12(mg/L)，通過培養基相關成分的篩選，得到一次擬合方程Y= 851.236 +11.049A+ 6.306B+5.993C+17.99D-2.23E -6.269F -1.051G +0.289H。所選的8種成分里葡萄糖和胰蛋白粉是顯著影響因子，該結果與相關文獻^[11,13]的報道一致。

 

2對篩選的顯著效應因子葡萄糖和胰蛋白粉進行爬坡實驗，不添加乙醇，氯化鎂，維生素溶液，其他因子濃度保持在低水平，在處理5達到最大，此時葡萄糖和胰蛋白胨濃度分別為30g/L和5g/L，隱甲藻生物量和DHA產量分別達到8.88±0.24（g/L），895.14±1..58（mg/L），并以此為后續中心組合設計的中心點。

 

3根據Box-Behnken設計，確定2因素3個水平得到實驗數據利用Minitab分析，得到回歸方程：Y=907.003+5.352A+2.997D-9.258A²-6.439D²-3.291AD，該方程擬合良好，求解出葡萄糖和胰蛋白粉的濃度為30.54g/L，5.03g/L, DHA產量理論值為907.94mg/L。為了證實預測值和真實值之間的擬合程度，以預測濃度再做三次平行，生物量和 DHA分別為8.91±0.11g/L和907.54±1.02 mg/L，分別是優化前2.68和2.48倍，與理論值擬合良好，說明有實際指導作用。

 

4通過單因素，PB，最陡爬坡，Box-Behnken中心組合的依次設計的實驗比純粹的單因素和正交實驗在理論水平上精細，嚴密，這樣可以逐漸縮小優化范圍，快速接近優化點而且能準確地用方程描述最佳控制條件^[14]。

 

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