飛行時(shí)間質(zhì)譜儀鑒定微生物介紹

    基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF)指紋圖譜法是一種微生物分類(lèi)和鑒定的快速可靠的方法，可廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境和分類(lèi)研究或者食品加工質(zhì)量控制中。BioTyperTM MALDI-TOF質(zhì)譜儀指紋圖譜法可使研究人員在幾分鐘內(nèi)就可鑒定不明細(xì)菌、酵母菌和霉菌。
    微生物表達(dá)譜分析的一般工作流程是一個(gè)直線性路徑。從一個(gè)單克隆或其它生物材料開(kāi)始，樣品可以在幾分鐘內(nèi)被分析。每個(gè)樣本的自動(dòng)譜圖獲取可以在幾秒鐘內(nèi)完成，并且可以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)向?qū)ｉT(mén)鑒定軟件的無(wú)縫傳輸。因此這項(xiàng)技術(shù)可以極好的替代經(jīng)典的微生物鑒定和分類(lèi)技術(shù)，它僅需要極少的樣品處理和費(fèi)用。
 
MALDI-TOF測(cè)定
    多數(shù)簡(jiǎn)單的樣品分析從將少量生物材料直接放置到MALDI-TOF靶盤(pán)開(kāi)始。初始材料可以是一個(gè)單克隆或者液體培養(yǎng)基離心的一個(gè)組分。微生物薄膜用基質(zhì)(α-氰基-4-羥基肉桂酸；HCCA)覆蓋。質(zhì)譜譜圖用MALDI-TOF質(zhì)譜儀以線性正性模式用最大頻率(20-200Hz，依賴(lài)于儀器)獲取。譜圖的測(cè)量質(zhì)量范圍是2000-20000Da。譜圖自動(dòng)獲取可以用Bruker’s ‘a(chǎn)utoExecute’軟件用激光強(qiáng)度的模糊控制來(lái)進(jìn)行。

重復(fù)性
    在很寬的條件范圍內(nèi)，該方法都被證明是很穩(wěn)定的。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的不同組成對(duì)峰模式分布影響非常小；在從4000到12000Da的范圍內(nèi)，幾乎沒(méi)有觀察到培養(yǎng)基的影響。附著在克隆上的培養(yǎng)基對(duì)峰模式?jīng)]有影響。同樣，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)峰模式也沒(méi)有影響。緩慢生長(zhǎng)期的細(xì)胞與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期或者死亡期的細(xì)胞具有相似的模式。
    此外，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行樣本制備和測(cè)量后，在不同的MALDI-TOF儀器上獲取的質(zhì)譜譜圖具有很高的可比性。在3個(gè)不同的儀器上，對(duì)同一樣本靶測(cè)量的譜圖實(shí)際上是一致的。因此，來(lái)自于不同MALDI-TOF質(zhì)譜儀的譜圖可以用來(lái)建立真實(shí)可靠的數(shù)據(jù)庫(kù)。
    這種方法學(xué)驚人的重復(fù)性是建立在對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的高豐度的蛋白質(zhì)測(cè)量基礎(chǔ)上的，比如核糖體蛋白質(zhì)。在很少出現(xiàn)代謝物的2000到20000Da質(zhì)量范圍內(nèi)，波譜圖也可被觀察到。與活細(xì)胞相比，細(xì)菌芽孢可以產(chǎn)生明顯不同的峰模式，而且這些“芽孢譜圖”也具有重復(fù)性。

軟件分析

    廠家提供的分析軟件整合了鑒定與分類(lèi)的處理質(zhì)譜譜圖的所有功能。這些處理參數(shù)是用戶(hù)可以定義的，并且結(jié)果是一個(gè)專(zhuān)門(mén)的峰列表。為了鑒定未知微生物，模式匹配是通過(guò)將產(chǎn)生的峰列表與含有大量種屬特征的波譜庫(kù)相比較來(lái)完成的。特征波譜庫(kù)是通過(guò)對(duì)已知細(xì)菌種屬和菌株在細(xì)微差別的條件下進(jìn)行的若干次測(cè)量來(lái)產(chǎn)生的。然后提取特征峰信息，好的平均數(shù)通過(guò)測(cè)量20個(gè)譜圖來(lái)獲得。軟件從整個(gè)譜集中自動(dòng)生成峰列表并提取典型峰，這些峰出現(xiàn)在從一種屬來(lái)源的一定數(shù)量的譜圖中。
    未知微生物通過(guò)它們各自的峰列表與數(shù)據(jù)庫(kù)的比較來(lái)鑒定。依據(jù)確定的質(zhì)量數(shù)和它們的強(qiáng)度的相關(guān)性生成一個(gè)匹配值，這個(gè)值用來(lái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序。為了提高數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的準(zhǔn)確性，BioTyper可通過(guò)先進(jìn)的再校準(zhǔn)算法來(lái)校正峰質(zhì)量數(shù)偏移。在峰提取之后，可以設(shè)定一個(gè)初始的可以接受的誤差窗口并得到一個(gè)想要的調(diào)節(jié)結(jié)果。軟件在可調(diào)節(jié)范圍內(nèi)可以進(jìn)行新的峰列表對(duì)已知峰列表的校準(zhǔn)。因此甚至質(zhì)量數(shù)偏差5000ppm的譜圖仍然可以被成功鑒定。這個(gè)功能使得BioTyper鑒定變得格外的可靠和準(zhǔn)確。
    為了減少重復(fù)，BioTyper提供了很多功能，如聚類(lèi)和生成家庭樹(shù)。依據(jù)相似性分值，可以建立樹(shù)狀圖。而且，一項(xiàng)基于要素分析的不受監(jiān)管的多變量分析成為可能。使用計(jì)算的要素成分，多種聚類(lèi)算法和可視化法都可達(dá)到。

應(yīng)用
    BioTyper給很多領(lǐng)域(例如環(huán)境研究、食品和水源控制和醫(yī)學(xué)診斷等)的傳統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定提供了一個(gè)卓越的方法，其樣品制備和測(cè)量快速、穩(wěn)定和低耗費(fèi)的特點(diǎn)使它非常適合常規(guī)和高通量應(yīng)用。
    這個(gè)方法對(duì)種系分類(lèi)分析也十分有用。MALDI-TOF質(zhì)譜儀表達(dá)譜分析可產(chǎn)生和經(jīng)典的16S核糖體DNA測(cè)序一樣的家庭樹(shù)，因?yàn)楹颂求w蛋白是高豐度且十分穩(wěn)定，所以觀察蛋白表達(dá)模式可以直接的考察DNA序列翻譯的情況。因此，確定分子質(zhì)量組成的方法和多基因位點(diǎn)測(cè)序一樣有價(jià)值。
    依據(jù)質(zhì)譜表達(dá)譜模式來(lái)降低復(fù)雜微生物群落的重復(fù)性為科學(xué)研究提供新的能力(如在環(huán)境研究和生物多樣性的調(diào)查方面)。成千上萬(wàn)的微生物可以通過(guò)BioTyper簡(jiǎn)單的進(jìn)行分析，然后可以作為進(jìn)一步分析的基礎(chǔ)。初始的微生物參考譜圖集可以用來(lái)進(jìn)行相互比較，冗余的可以去除。進(jìn)一步分類(lèi)的微生物可以與初始的參考數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較，然后去除或者加入譜圖庫(kù)來(lái)創(chuàng)建微生物多態(tài)性的概貌。