摘要：
化學發光免疫分析是將化學發光與免疫分析方法相結合，綜合了化學發光的高靈敏度和免疫分析的高選擇性，被廣泛應用到臨床檢測和藥物分析中。隨著新的發光試劑，新固相材料的研制以及新標記技術應用，化學發光免疫分析方法的靈敏度，重現性將大大提高。

 

 

在分析化學中，化學發光是當基態分子吸收化學反應中釋放的能量躍遷到激發態，處于激發態的分子以光輻射的形式返回到基態時產生的光。基于化學發光強度和被測物含量之間的關系建立的分析方法叫化學發光分析法，化學發光與高效液相色譜、毛細管電泳、免疫分析等技術的結合，具有靈敏度高，線性范圍寬，儀器簡單、操作簡便等特點，已廣泛地應用于環境、臨床、食品和工業分析中。將化學發光與免疫分析方法相結合，綜合了化學發光的高靈敏度和免疫分析的高選擇性，近年來，成為研究的熱點。

 

化學發光免疫分析根據發光體系應用于免疫分析中的方式不同可分為：直接標記發光物質的免疫分析、酶催化化學發光免疫分析和電化學發光免疫分析。

1．1直接標記發光物質的免疫分析
該方法是用化學發光劑直接標記抗原或抗體。常用于標記的化學發光物質有吖啶酯類化合物，是有效的發光標記物，其通過起動發光試劑的作用而發光，強烈的直接發光在1S內完成，為快速的閃爍發光。吖啶酯作為標記物用于免疫分析，其化學反應簡單、快速、無需催化劑；檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結合少，本底低；與大分子的結合不會減小所產生的光量，從而增加靈敏度。張皓等采用直接化學發光技術進行的全自動雙抗夾心免疫測定方法，對130例患者測定血清B—HCG含量法。用化學發光免疫分析法檢測．HCG，操作簡便、敏感度高、特異性強，優于一般的酶聯免疫法和放射免疫法，適合于臨床實驗室推廣使用。

 

1．2酶催化化學發光免疫分析
從標記免疫分析角度，酶催化化學發光免疫分析應屬酶免疫分析，只是酶反應的底物是發光劑，操作步驟與酶免疫分析完全相同：以酶標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體)進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發光底物，在信號試劑作用下發光，用發光信號測定儀進行發光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，它們有各自的發光底物。辣根過氧化物酶常用的底物為魯米諾或其衍生物如異魯米諾，魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行，在過氧化物酶及活性氧(過氧化陰離子、單線態氧、羥自由基、過氧化氫)存在下，生成激發態中間體，當其回到基態時發光，其波長為425nln。鈕心怡等采用特異性的兩株C．P單克隆抗體，辣根過氧化物魯米諾酶促增敏化學發光體系，利用雙抗體夾心法檢測。敏感度為0．102 g／L；檢測線性范圍為0．102～20 L；多人次檢測證實試劑盒批內變異均小于10％，分析間變異小于15％；與18 g／L人胰島素原、2000mIU／L的人胰島素無顯著交叉反應。

 

堿性磷酸酶所用底物為環1，2．二氧乙烷衍生物用于化學發光酶免分析底物而設計的分子結構中包含起穩定作用的基團——金剛烷基，其分子中發光基團為芳香基團和酶作用的基團，在酶及起動發光試劑作用下引起化學發光。馮艷銘等_3』采用雙抗體異位點一步夾心法，以甲胎蛋白單克隆抗體作為固相包被，采用改良過碘酸鈉法進行甲胎蛋白多克隆抗體與堿性磷酸酶偶聯制備酶標抗體；以金剛烷胺衍生物CSPD作為底物，優化CSPD與SapphireII發光體系用國家標準品校定定量標準品，建立了人血清AFP的化學發光免疫定量分析法。利用化學發光酶免疫分析方法，以堿性磷酸酶作為標記物，環1，2一二氧乙烷衍生物AMPPD為發光底物，測定血清中的糖抗原50，檢出限為1．0umL～，線性范圍為0～300umL一。

批內精密度<7％，批內精密度為11％。

 

1．3電化學發光免疫分析
電化學發光免疫分析的反應在電極表面進行，發光底物為三聯吡啶釕，用另一反應物三丙胺來激發光反應。在陽極表面，這兩種物質可同時失去電子，發生氧化反應。在電極板上二價的三聯吡啶釕迅速被氧化成三價三聯吡啶釕，與此同時三丙胺也在電極板上被氧化成三丙胺陽離子自由基，三丙胺陽離子自由基自發地釋放一個質子而變成三丙胺非穩定分子，將一個電子遞給三價三聯吡啶釕，形成激發態的二價三聯吡啶釕。激發態的二價三聯毗啶釕在衰減的同時發射一個波長為620／l／n的光子，重新回到基態二價三聯吡啶釕。這一過程在電極表面反復進行，產生高效、穩定的連續發光，并不斷增強。張繼東用電化學發光免疫分析法在檢測乙肝標志物，發現用電化學方法檢測，靈敏度更高，專屬性更強。

 

化學免疫分析方法的新進展主要表現在新的標記物以及標記技術的應用，新型固相載體的應用以及聯用技術。

2．1新的標記物
近年來，科學家們致力于化學發光物質的研究，通過往發光體系中加入增加化學增強劑來增加量子產率以及發光時間。同時一些學者將目光集中于新的標記發光物的開發中。并取得了相應成果。目前已證明從棕櫚樹和大豆中提取的HRP的陰離子型同工酶(HRP2A)在沒有增強劑的情況下可以高效、常時間催化luminol—H2O2體系發光，并且HRP．A比HRP—C穩定性更好，這在酶標記物的儲存中是非常重要的。而白細胞堿性磷(Leukocyte Alkaline Phosphatase，LAP)與AIJP一樣，也有催化性能，并已用于化學發光的檢測。此外，還通過合成技術合成了吖啶酯類化學發光試劑。Zhuang等合成了一種新型雙吖啶化合物：1O，102二甲基23，32二磺基29，9'2二雙吖啶(DMDSBA)，并詳細研究了它的化學發光性質。DMDSBA被用于標記抗一CEA抗體。標記的比率接近1．15～1．32，平均標記比例是1．25。結果表明，連接到抗一CEA抗體后，標記抗體的免疫反應活性與DMDSBA的量子效率沒有明顯改變。建立了一種新的夾心化學發光免疫方法，測定人血清中CEA的線性范圍為1．0～100ng／mL，檢測限0．53ng／mL。

 

2．2新標記技術的應用
固相標記方法的應用，減少游離標記物以及聚合蛋白質；納米技術與生物分析的結合，即利用Au、Ag等陽離子對化學發光具有催化放大作用，提高檢測靈敏度。HonglanQ等利用電化學發光免疫分析方法，將N．氨丁基一N．異魯米諾(ABEI)作為發光標記試劑標記在金毫微粒改性的石蠟活化的石墨電極上，測定人體[gG。電化學發光的強度大大增強，ABEI檢出限為2×10^-14 mol／L(S／N=3)，lgG的檢出限為1×10。g／mL(S／N=3)。線性范圍為3．0×10^-ll～1．0×10^-9g／mL。在濃度為1．0×10^-10／mL時的RSD為3．1％。說明金微粒化學發光的催化放大作用在化學發光免疫分析方法中有很大的應用前景。量子點(quantumdots，QDs)又稱半導體納米微晶體，是一種由Ⅱ．Ⅵ族或Ⅲ．V族元素組成的能夠接受激光產生熒光的半導體納米顆粒，直徑約為2～6nm。與CLIA常用標記酶和熒光素相比，QD不易失活，受外部環境影響小，性質穩定，重現性好激發光譜范圍寬，而發射光譜窄且對稱，是不可多得的標記物。

 

2．3新固相材料的應用
新固相材料主要體現在(1)表面有與蛋白結合的官能團，可以充分固定抗體抗原；(2)表面性質要保證不影響結合后蛋白的免疫反應活性；(3)比表面積要足夠大以固定足夠量蛋白(4)應具有親水性以避免與待測物和樣品基質的非共價結合；(5)在載液的沖擊下保持表面的抗體結合活性。目前用于丌．的固相材料主要有尼龍、瓊脂糖凝膠、磁性粒子，以及二氧化硅可控孔度玻璃(Controlled poreglass，CPG)和玻璃微珠_IJ等有機硅材料。

 

2．4與其他技術聯用
目前研究最多的是毛細管電泳一化學發光免疫分析技術(CECLIA)結合了CE對生物樣品分離的高效分離和CLIA的高靈敏度檢測。王軍華等利用毛細管電泳免疫化學發光檢測鼠血管平滑肌細胞中zmol骨形成蛋白．2，采用辣根過氧化物酶(HRP)催化魯米諾．過氧化氫，以對碘苯酚增強其化學發光反應，HRP檢出限為4．4pmol／L(53zmo1)，是目前報道檢測HRP的最高靈敏度之一。用毛細管電泳化學發光免疫方法測定了人血清中乙肝表面抗原和抗體，并與酶免疫分析方法比較，驗證了毛細管電泳化學發光免疫技術用于臨床的可行性。流動注射化學發光免疫技術流動注射化學發光分析技術是將化學發光分析和流動注射相結合的一種高靈敏度的微量及痕量分析技術，其分析速度快、器設備簡單，是當前分析化學領域中研究的熱點。利用順序流動注射技術分析非離子型表面活性劑，線性范圍0～1000ppb，最低檢出限為10ppm每個樣品的分析時問為15min，已經被成功用于河水中anti-ApnEOs的檢測。

 

化學發光免疫分析方法作為一種高選擇、高靈敏度檢測方法，已經被廣泛應用臨床檢測和藥物分析中。隨著新的發光試劑，新固相材料的研制以及新標記技術應用，化學發光免疫分析方法的靈敏度，重現性將大大提高。各種聯用技術的出現，如毛細管電泳一化學發光免疫技術的聯用，大大提高了化學發光免疫的選擇性和重現性。被廣泛應用于臨床檢測和藥物分析中，并朝著自動化、智能化、微型化方向發展。

（長春中醫藥大學學報 翟艷，王卉）