用陣列式SPR傳感器ProteOn XPR36系統(tǒng)進行抗體開發(fā)和研究
現(xiàn)在Bio-Rad公司推出的一種新型陣列式SPR生物傳感器技術(shù)有望徹底打破現(xiàn)有方法的各種瓶頸，做到較高通量的基礎(chǔ)上同時獲得濃度、親和力以及反應(yīng)動力學(xué)等相關(guān)數(shù)據(jù)。這種新型陣列式SPR生物傳感器叫ProteOn XPR36系統(tǒng)。如下圖所示，它具有可90°旋轉(zhuǎn)的6通道流動池，可在芯片上產(chǎn)生縱向或者橫向的通道各6條。首先，流動池旋轉(zhuǎn)成縱向，在縱向的6個通道里可以標記最多6種不同的ligand在芯片上，隨后流動池旋轉(zhuǎn)90°變成橫向，流過6個analyte，當analyte溶液接觸原先標記的ligand時發(fā)生的相互作用即可被檢測并記錄下來。通過這樣的分析方式可以實現(xiàn)高通量平行分析。
使用ProteOn XPR36系統(tǒng)進行抗體篩選和優(yōu)化，Bio-Rad公司給出了一個完全不同于傳統(tǒng)方法的新工作流程，如下圖所示。
第一步，橫向6個通道上標記捕獲試劑，即可以和單抗結(jié)合的分子，如Anti-mouse IgG、Protein A/G等，如果篩選抗體Fab段，可以標記Anti-(Fab’)2。標記完成后，通道旋轉(zhuǎn)90°變成縱向，進入第二步。
第二步是從細胞培養(yǎng)液中捕獲單抗，一次最多流過6個克隆。如果表達有單抗，儀器會顯示出一條向上的曲線，并且濃度越高，曲線上升得越快。如果定義了標準曲線，可以把濃度數(shù)值算出來。這一步完成后，抗體或抗體片段就結(jié)合在了捕獲試劑上。
第三步，通道再轉(zhuǎn)回橫向，流過5個不同濃度的抗原分子加一個緩沖液作為陰性對照。這一步可以得出下圖右下方所示的6幅動力學(xué)反應(yīng)曲線，分別代表6個克隆的單抗和抗原反應(yīng)的結(jié)果，我們可以據(jù)此計算出6個抗體和抗原的動力學(xué)數(shù)據(jù)和親和力常數(shù)。
第四步，用磷酸或pH2.0的甘氨酸溶液再生，把抗原連同抗體一塊兒從捕獲試劑上洗下來，為檢測下一批單抗做準備。
按照這一流程，每個循環(huán)可以測定6個克隆的表達水平和動力學(xué)數(shù)據(jù)。當所有克隆都檢測完畢后，我們可以繪制一張包含所有克隆的動力學(xué)分布圖，如下圖所示。
上圖縱坐標代表解離速率常數(shù)（koff），橫坐標代表結(jié)合速率常數(shù)（kon），斜線是等親和力線，也就是說分布在同一條等親和力線上的克隆親和力是一樣的。我們可以根據(jù)需要挑選特定區(qū)域內(nèi)的克隆，然后進行抗體特性分析。
這一流程的好處是初步篩選得到大量的抗體信息，基本不需要再挑克隆進行第二步篩選就可以直接把我們需要的克隆挑出來純化或者進行進一步分析，確定其亞型、抗原識別表位等。
有人也許會問一些問題，現(xiàn)在就這些問題回答如下：
1．這樣做一天能篩選多少克隆？
答：200個左右。這個數(shù)字聽起來似乎令人沮喪，但別忘了，這是包含大量信息的篩選，一步能頂傳統(tǒng)方法多步的工作，其實更省時間。
2．需要耗費的捕獲試劑和抗原量很多嗎？
答：一點也不多，捕獲試劑大約消耗數(shù)微克，抗原消耗則需要根據(jù)篩選的克隆數(shù)來定，如果篩1000個克隆，抗原消耗通常不超過1毫克。
3．整個流程的成本高嗎？
答：一點也不高，只需一塊芯片就能完成上千克隆的篩選，和其它消耗加在一起的總成本只比ELISA高一點。如果考慮傳統(tǒng)方法篩選完成后可能還需測定動力學(xué)數(shù)據(jù)，其實這樣做的成本會更低
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