畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)介紹

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的一種真核表達(dá)系統(tǒng)。它是甲醇營養(yǎng)型酵母菌，有兩個乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）編碼基因AOX1和AOX2，兩種序列相似，AOX1基因嚴(yán)格受甲醇誘導(dǎo)和調(diào)控。當(dāng)甲醇為唯一碳源時，AOX1啟動子可被甲醇誘導(dǎo)，啟動乙醇氧化酶的表達(dá)，從而用甲醇進(jìn)行代謝，含AOX1啟動子的質(zhì)粒可用來促進(jìn)編碼外源蛋白的目的基因的表達(dá)。

GS115：AOX1和AOX2基因都正常表達(dá)AOX蛋白（乙醇氧化酶），甲醇的利用率高，接近于野生型，屬于甲醇快速利用型（Mut+）

KM71：AOX1基因被大部分剔除，只能利用AOX2為AOX編碼，甲醇的利用速率變慢，表現(xiàn)為甲醇慢利用型（Muts）

外源基因的整合方式不同會導(dǎo)致表達(dá)菌株的表型不同：

菌株表型

載體信息

對于胞外表達(dá)的蛋白除了可以用載體自帶的信號肽，還有以下信號肽可供選擇：

信號肽序列

1. 含有特有的強(qiáng)有力的AOX（醇氧化酶基因）啟動子，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)。

2. 培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離，畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基成本合理，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機(jī)鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分離純化。

3. 外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能得到高表達(dá)菌株。

4. 作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。

1. 具備完備的畢赤酵母表達(dá)平臺，可以根據(jù)蛋白特性或客戶的需求設(shè)計不同的實(shí)驗(yàn)方案；

2. 具有高通量的篩選平臺，可以快速有效的得到最佳表達(dá)條件；

3. 具有大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)能力

表達(dá)載體pPIC3.5K（胞內(nèi)表達(dá)），目的蛋白32.49KD（理論值）

表達(dá)菌株：GS115/KM71

誘導(dǎo)條件：甲醇濃度0.5%/1%，誘導(dǎo)時間24h/48/72h

結(jié)果分析：從SDS-PAGE膠圖中可以看到，目的蛋白（糖基化后40KDa左右）有明顯表達(dá)，其中GS115-5#-24h，0.5%甲醇，GS115-2#-48h，1%甲醇，GS115-3#-48h，01%甲醇，KM71-1#-72h，1%甲醇，都有很明顯的目的條帶，目的蛋白成功表達(dá)。