代謝組學一般根據以下四個維度對代謝物鑒定的可信度進行劃分：可靠的鑒定得到的化合物（1級），通過假定注釋得到的化合物（2級），通過假定注釋對化合物類別進行鑒定（3級）和未知化合物（4級）。1級鑒定需要將目標代謝物的兩個或多個正交特性（如保留時間、m/z和碎片質譜）與在相同分析條件下觀察到的真實化學標準品的相同特性進行比較。推定（第2級或第3級）注釋基本上僅依賴于一個或兩個特性，且通常基于對不同實驗室收集的以及不同分析方法獲得的數據的比較，而不是在相同分析條件下與真正的化學標準品的直接比較。
未知代謝物指可以反復檢測到的但其化學身份尚未確定的小分子。這些化合物雖然尚未被鑒定和分類，但在代謝組學實驗中仍可根據光譜數據進行區分和定量。在LC-MS實驗中，一個未知化合物將由唯一的保留時間、一個或多個質量或一個特定的初級離子碎片模式定義。在NMR實驗中，一個未知化合物將由化學位移的模式定義。未知物可能代表先前沒有被識別的小分子，例如代謝的次級產物或罕見的外源性物質，或者它們可能由已建立的途徑構成分子但無法分配到現有的NMR參考譜庫或MS碎裂模式。
未知化合物的鑒定非常耗時且成本高昂，通常需要進行制備規模的分離以進行NMR研究，或大量的化學合成才能使用MS/MS進行結構比較。因此，大多數報告都集中于檢測具有可用的真實商業標準品或至少存在于代謝物數據庫中的代謝物，即分類為1級，2級和3級的代謝物。由于許多代謝物固有的不穩定性和需求的缺乏，僅有數千種商業分析標準品可用。然而，這些標準品和數據庫中存在的代謝物僅占內源性代謝物很小的一部分。因此，對于代謝組學研究來說，有效的方法來排序、研究和最終鑒定非特征代謝物是非常重要的。未知代謝物的成功鑒定將對生物標志物的發現和組學研究產生重大影響。
未知代謝物鑒定
為了鑒定代謝組學樣品中的未知化合物，應區分不同類別的代謝物，具有相同可分辨公稱質量（nominal mass）的，具有相同可分辨公稱質量但分子式和同位素質量不同的，相同可分辨公稱質量和同位素質量但化學結構不同的，都應該對其進行區分。例如，亮氨酸和異亮氨酸是結構不同的異構體，但是可分辨公稱質量和同位素質量相同。此外，由于單一代謝物可以在質譜儀中檢測到不同的衍生物種，所以正確地將不同的衍生物種分配給母體代謝物也是很重要的。例如，在氨基酸分析中，三甲基硅烷化（TMS）與氨基酸發生化學衍生反應會生成含有1、2或3個TMS基團的氨基酸，這些氨基酸都應屬于同一母體氨基酸。
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