免疫熒光染色技術是將熒光素作為抗體標記物進行免疫組織化學染色,帶有熒光素的抗體孵育后可以直接使用熒光顯微鏡觀測。該技術的主要特點是:特異性強、敏感性高、速度快;缺點是由于熒光素有一定的淬滅周期,玻片無法長期保存,需要在染色結束后盡快進行鏡下觀測分析。
免疫熒光染色分為直接法和間接法。直接法是熒光素直接標記在一抗上,孵育后直接觀測,快速高效,還可以與多個標記抗體一起做多重熒光染色。間接法是熒光素標記在二抗上,相比直接法染色背景更干凈,費用花費也少。
免疫熒光染色與免疫組化前期處理相同,因為內源性過氧化物酶對免疫熒光實驗沒有影響,同時雙氧水反而會干擾到熒光素發光,所以這步操作在免疫熒光中不需要做。
常用的熒光顯微鏡一般有三個通路,激發波長為350nm、488nm、555nm附近,分別對應的熒光發射光顏色為藍光、綠光、紅光。
350nm常用熒光素:DAPI(復染用),Alexa Fluor 350
488nm常用熒光素:FITC,Alexa Fluor 488
555nm常用熒光素:PE、Cy3、Rhodamine B、Alexa Fluor555
另有其他常見熒光素
594nm常用熒光素:Texas Red、Alexa Fluor594
647nm常用熒光素:Cy5、APC、Alexa Fluor647
免疫熒光雙重染色熒光雙染或多重染色是指將帶有不同熒光素標記的抗體孵育在同一張切片上,鏡下觀察時將不同的顏色組合在一起,將不同的抗原表達情況一起呈現出來,這樣分析多個抗原的關聯性更客觀、更直接。
熒光雙染也有直接法和間接法。直接法是使用帶有不同熒光素標記的兩個抗體同時孵育后觀測;間接法需要用到兩個不同種屬來源的一抗(例如一個鼠源抗體,一個兔源抗體),后面要選擇與一抗相對應的二抗同時需要帶有不同的熒光素標記(例如FITC標記山羊抗小鼠和Cy3標記山羊抗兔),間接法需要同時兼顧一抗和二抗的種屬關系,避免出現相互的交叉反應。
北京博奧森生物石蠟切片的免疫熒光單染(間接法)
1.石蠟切片正常脫蠟至水,PBS洗5分鐘,2次
2.抗原修復,0.01M枸櫞酸修復液,沸水浴熱修復15分鐘
3.正常山羊血清封閉20分鐘,37℃
4.一抗孵育,4℃過夜。
5.PBS洗5分鐘,3次
6.熒光標記二抗孵育,37℃,90分鐘
7.PBS洗5分鐘,3次
8.DAPI復染,PBS洗5分鐘,3次
9.防淬滅熒光封片劑封片
10.鏡檢
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北京博奧森生物技術有限公司成立于2001年,注冊資本2000萬元,是集免疫學科研試劑研發、生產、銷售為一體的國家高新技術企業。在公司近1300平米的研發中心樓內,擁有SPF級實驗動物房、GMP級單克隆抗體制備平臺,同時購置了CSBio多肽合成儀、Akta全自動液相色譜系統、BD流式細胞儀、Leica冷凍切片機等多種生產、檢測儀器。公司還擁有一批技術精湛、經驗豐富的科研開發團隊,在免疫和分子生物學等領域擁有多項自主知識產權。
自成立之初,公司始終秉持“自主研發、原始創新,為全球生命科學研究提供優質服務”的經營理念。提供全面的科研抗體、試劑,診斷抗體原料,以及CRO服務。公司現擁有近兩萬種抗體產品,涵蓋人蛋白靶點13000多個。特色產品有特異磷酸化抗體及專利授權AF熒光標記抗體等。此外,公司還提供完善的單/多克隆抗體制備、標記、重組蛋白、多肽合成及各項免疫學檢測技術服務等。公司恪守ISO9001:2008國際質量管理體系認證要求,致力于打造“Bioss”精品抗體品牌。 2010年博奧森(波士頓)在美國設立了面向全球抗體市場的商務拓展及國際市場營銷總部,不斷擴展全球銷售體系,主打Bioss國際品牌,向全球科研工作者提供高質量的科研抗體產品。迄今為止,Bioss產品已遍布全球多個國家和地區,并已成為數家國際知名抗體公司的OEM合作伙伴。Bioss抗體產品已出現在數千篇高質量SCI文章中,獲得了全世界眾多生命科學領域科研人員的認可。
百舸爭流,只爭朝夕。近二十年的探索和拼搏,為Bioss品牌在免疫學試劑領域奠定了堅實的基礎。我們將在未來勇于開拓,自主創新,為生命科學研究提供更加優質的產品和服務,回報全球用戶的信任,為生命科學進步盡綿薄之力。
溫馨提示:產品僅用于實驗室科研及非臨床用途。