一【檢測步驟】
、測定前須知:
1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫(20~25℃)。
2. 使用之后立即將所有試劑及剩余的板條放置2~8℃。
3. ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA操作中的要點(diǎn)。
4. 在所有的恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟:
1. 將所需試劑從微孔板中取出,放置室溫(20~25℃)30min以上,液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出所需數(shù)量的微孔板,將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封,保存于2~8℃。不要冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔編號,每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50ml到對應(yīng)的微孔中,加入酶標(biāo)物50ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光環(huán)境中反應(yīng)30min。
6. 小心揭開蓋板膜,用洗滌工作液充分洗滌300ml/孔, 洗板5次,每次間隔30s,用吸水紙拍干。
7. 加入顯色液100ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光環(huán)境反應(yīng)30min。
8. 加終止液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀每孔OD值。
【注意事項(xiàng)】
1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有恢復(fù)到室溫(20~25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應(yīng)終止液為2M鹽酸,避免接觸皮膚。
5. 不要使用過了有效期的試劑盒;也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒;不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6. 儲存條件:
試劑盒保存于2~8℃,不要冷凍,將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的顯色劑對光敏感,因此要避光保存。
7. 試劑變質(zhì)的跡象:
顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
8. 加入顯色液后,一般顯色時(shí)間為15~30min。若顏色較淺,可延長反應(yīng)時(shí)間到35min(或更長),但不得超過40min。反之,則減短反應(yīng)時(shí)間。
9. 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
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