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卵巢癌類器官培養(yǎng)基是一種為促進人源卵巢癌類器官體外形成和擴增而開發(fā)的培養(yǎng)基。它是一種無菌的液體混合系統(tǒng),含有必需和非必需的氨基酸、維生素、有機和無機化合物、激素、生長因子、微量礦物質(zhì)等。該培養(yǎng)基的獨特配方可以提供一個合適的人源卵巢癌類器官體外培養(yǎng)環(huán)境,選擇性地促進體外人源卵巢癌類器官的生長。
2~8℃避光保存2個月內(nèi)有效。
1. 卵巢癌類器官培養(yǎng)
將獲取的卵巢癌原代細胞懸液計數(shù),根據(jù)計算好的體積吸取細胞懸液加入預(yù)冷的1.5 mL離心管中,補齊預(yù)冷的卵巢癌類器官培養(yǎng)基至所需體積,將預(yù)冷后的細胞懸液加入等體積的Matrigel基質(zhì)膠(Corning)中輕輕混勻(全程冰上操作),使得卵巢癌原代細胞終濃度為5X105個細胞/毫升。然后將細胞與基質(zhì)膠的混合液按照50-60 μL/孔呈半球形點膠于24孔板。將培養(yǎng)板放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱終至少30 min,待Matrigel膠完全凝固。沿孔壁每孔緩慢加入500 μL預(yù)先恢復(fù)至室溫的類器官培養(yǎng)基,置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3天后鏡下觀察類器官形成情況,粒徑大于30~50 μm即認為類器官已經(jīng)形成,每5天更換一次培養(yǎng)基進行培養(yǎng),持續(xù)觀察類器官大小,鏡下觀察大部分類器官大小均大于30~50 μm且大小不再增大即可收集類器官進行后續(xù)實驗。
2. 卵巢癌類器官收集
棄培養(yǎng)基,每孔加入500 μL預(yù)冷DF12,反復(fù)吹打至基質(zhì)膠完全脫離板底,收集至15 mL離心管中,1500 rpm離心5 min,輕輕吸去上清和基質(zhì)膠層,待用。
3. 卵巢癌類器官傳代
收集的類器官,加入3-5 mL類器官解離試劑(PRS-ODR),37℃,200 rpm水平搖床振蕩消化(具體時間根據(jù)類器官大小和數(shù)量決定,以肉眼可見顆粒明顯減小一半為準,可中間取消化的類器官顯微鏡觀察,類器官消化至包含有3~10個細胞的細胞團塊最佳);消化完全后采用等體積的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。1500 rpm離心3 min,棄上清,使用清洗液重懸沉淀后1500 rpm再次離心3 min;加入預(yù)冷的胃癌類器官培養(yǎng)基進行重懸,計數(shù),按照培養(yǎng)步驟操作繼續(xù)培養(yǎng)。