當B16小鼠黑色素瘤細胞密度達到傳代密度且細胞活性在90%以上時，可以凍存細胞，在超凈臺中將要凍存的細胞移入離心管，1000rpm離心5min，棄上清，用90%培養液+10%DMSO的混合液重懸細胞，并調整細胞密度為4-6×106/ml，將細胞懸液分裝到凍存管中(1-1.5ml/管)。

含量：>1x10⁶ 個/mL，  規格：T75瓶或者1mL凍存管包裝

培養基：RPMI-1640(GIBCO,貨號31800022, 添加NaHCO3 1.5g/L, glucose 2.5g/L, Sodium Pyruvate 0.11g/L)，90%；胎牛血清，10%。 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度。

生長特性：貼壁生長

污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

運輸和保存：可選擇干冰運輸及發送復蘇存活細胞方式：（1）干冰運輸，收到后立即轉入液氮凍存或直接復蘇；（2）存活細胞，收到后應繼續生長，傳代達到細胞生長狀態良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養步驟。

B16小鼠黑色素瘤細胞傳代操作步驟：

一、貼壁細胞傳代

1.提前將培養基、PBS放入37℃水浴鍋內預熱，用75%酒精擦拭后再放入超凈臺內。

2.吸除或倒掉細胞瓶內舊培養液，加少量PBS潤洗細胞。

3.加入適量胰酶，使胰酶的量能蓋住細胞，37℃孵育，每隔2~3min顯微鏡下觀察，待貼壁細胞間間隙變大、細胞趨于圓形但還未漂起時棄去胰酶，加入新鮮培養基，晃動細胞瓶，終止胰酶作用。

4.B16小鼠黑色素瘤細胞用吸管小心吹打貼壁的細胞，制成細胞懸液。控制吹打的力度，避免產生大量的氣泡。

5.將細胞懸液分別接種到另外的2~3個細胞瓶內，加入新鮮培養基，置37℃溫箱培養，隔天觀察貼壁生長情況。

二、懸浮細胞傳代

1.將細胞懸液轉移到無菌離心管內，1000rpm離心5min。

2.棄去上清，加入新鮮的培養基，用吸管小心吹散沉淀，制成細胞懸液。

3.將細胞懸液分別接種到另外的2~3個細胞瓶內，加入新鮮培養基，置37℃溫箱培養。

B16小鼠黑色素瘤細胞 培養的過程中，經常見到黑色的顆粒或小黑點，這種情況是怎么引起的呢？該怎么避免呢？原因：

黑點，大概有細胞本身帶的，環境有的，還有人身上帶進細胞間的,還有就是血清和培養基

1、如果小黑點有增殖趨勢，那么就有可能是污染了，需要處理；

2、如果小黑點沒有增殖趨勢，且不影響細胞生長，也不影響實驗的話，則可能

 a、是“黑膠蟲”，黑膠蟲究竟是一種生物還是非生物，本身就存在爭議。有人認為是從血清中來的一種原蟲，也有人認為是細菌，或是真菌，也有人認為是血清中的蛋白的結晶。“黑膠蟲”可寄生于動物細胞，也可以生存于培養基中，依靠B16小鼠黑色素瘤細胞和培養基中的營養為生，并隨細胞傳代而傳代。“黑膠蟲”與細胞競爭性生長，開始時對細胞并沒有什么影響，但當黑膠蟲的數量多到一定程度的時候， 細胞生長就會受到影響直至死亡，嚴重影響了科研活動的開展和進行。以前（這個至少是10年以前），很多實驗室在養細胞時用國產血清，那時的血清可能質量不過關，有所謂的“黑膠蟲”，但是也沒有明確的鑒定。但是現在的血清，即使國產的，產品里這種現象就少見了。

 b、是細胞碎片，或血清里德沉淀析出，在做布朗運動。

 c、是核糖體，也可能是雜質ZYC3758    大鼠骨髓間充質干細胞    RMSC-bm    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3759    大鼠肺間充質干細胞    RPMSC    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3760            形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3761    豬細胞系統        形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3762    豬視網膜星形膠質細胞    PRA    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3763    豬角膜上皮細胞    PCEpiC    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3764    豬視網膜色素上皮細胞    PRPEpiC    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3765    豬晶狀體上皮細胞    PLEpiC    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3766            形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3767    馬和狗細胞系統        形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3768    馬間充質干細胞--脂肪    HMSC-ad    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 

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