4℃避光保存1個月內有效。

　　1. 乳腺癌類器官培養

（1）消化后的細胞懸液進行計數。

（2）按每孔1~2×104個細胞密度計算所需細胞數，根據計算好的體積吸取細胞懸液加入預冷的1.5 mL離心管中，離心，棄上清，將細胞沉淀置于冰上。

（3）按1：2體積比，將一份體積的含1%BSA的DMEM加入2份體積的細胞外基質膠（Corning#356231）中，輕輕混勻（全程冰上操作），然后在冰上將配好的基質膠混合液與細胞沉淀充分混勻。

（4）將細胞沉淀與基質膠的混合液按照35 μL/孔滴在已提前預熱好的24孔板中央，使之形成圓頂狀膠滴。緩慢將細胞培養板移至培養箱至少30 min。

（5）待基質膠完全凝固，沿24孔壁緩慢加入1 mL/孔預先恢復至室溫的本類器官培養基，并將培養板置于37℃，5%CO2條件下靜置培養。

（6）鏡下觀察類器官形成情況，每3~4天更換一次培養基。

　　2. 乳腺癌類器官的收集

（1）棄培養基，每孔加入1 mL預冷的無血清DMEM:F12培養基并用該培養基潤洗槍頭，反復吹打至圓頂狀膠滴完全脫離板底，將孔內吹散后的類器官混合液收集至15 mL離心管中。重復操作一次。將兩次洗脫下來的類器官混合液合并收集至同一離心管中，1500 rpm離心5 min，輕輕吸去上清和基質膠層，沉淀待用。

（2）沉淀加入3-5 mL類器官解離試劑（PRS-ODR），37℃，200 rpm水平搖床上解離10 min（具體解離時間根據類器官大小和數量決定，以肉眼可見顆粒明顯減小一半為準，可中途取解離的類器官顯微鏡下觀察，類器官解離至平均包含有5~10個細胞的細胞團塊大小最佳）。

（3）解離結束后加入和解離試劑等體積的含10%FBS的DMEM稀釋。1500 rpm離心3 min，棄上清，待用。

　　3. 乳腺癌類器官傳代

（1）收集好的細胞沉淀（以無肉眼可見基質膠狀沉淀為準）加入1~2 mL預冷的含1%BSA的DMEM培養基重懸，在4℃下，1500 rpm，離心5 min。

（2）小心吸棄上清，沉淀用乳腺癌類器官培養基重懸計數。

（3）按照步驟3（2）~（6）的操作，以大約1000個類器官/孔密度重新接種類器官，并繼續擴大培養。