當hEM15A人子宮內膜異位癥患者在位內膜間質細胞永生化細胞密度達到傳代密度且細胞活性在90%以上時，可以凍存細胞，在超凈臺中將要凍存的細胞移入離心管，1000rpm離心5min，棄上清，用90%培養液+10%DMSO的混合液重懸細胞，并調整細胞密度為4-6×106/ml，將細胞懸液分裝到凍存管中(1-1.5ml/管)。

含量：>1x10⁶ 個/mL，  規格：T75瓶或者1mL凍存管包裝

培養基：DMEM/F12(1:1):Ham＇sF12/DMEMedium(DMEH-16/F-1250%Mixturew/oHEPES,withNEAAMedium)15%FBS

生長特性：貼壁生長

污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

運輸和保存：可選擇干冰運輸及發送復蘇存活細胞方式：（1）干冰運輸，收到后立即轉入液氮凍存或直接復蘇；（2）存活細胞，收到后應繼續生長，傳代達到細胞生長狀態良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養步驟。

hEM15A人子宮內膜異位癥患者在位內膜間質細胞永生化細胞傳代操作步驟：

一、貼壁細胞傳代

1.提前將培養基、PBS放入37℃水浴鍋內預熱，用75%酒精擦拭后再放入超凈臺內。

2.吸除或倒掉細胞瓶內舊培養液，加少量PBS潤洗細胞。

3.加入適量胰酶，使胰酶的量能蓋住細胞，37℃孵育，每隔2~3min顯微鏡下觀察，待貼壁細胞間間隙變大、細胞趨于圓形但還未漂起時棄去胰酶，加入新鮮培養基，晃動細胞瓶，終止胰酶作用。

4.hEM15A人子宮內膜異位癥患者在位內膜間質細胞永生化細胞用吸管小心吹打貼壁的細胞，制成細胞懸液。控制吹打的力度，避免產生大量的氣泡。

5.將細胞懸液分別接種到另外的2~3個細胞瓶內，加入新鮮培養基，置37℃溫箱培養，隔天觀察貼壁生長情況。

二、懸浮細胞傳代

1.將細胞懸液轉移到無菌離心管內，1000rpm離心5min。

2.棄去上清，加入新鮮的培養基，用吸管小心吹散沉淀，制成細胞懸液。

3.將細胞懸液分別接種到另外的2~3個細胞瓶內，加入新鮮培養基，置37℃溫箱培養。

hEM15A人子宮內膜異位癥患者在位內膜間質細胞永生化細胞 培養的過程中，經常見到黑色的顆粒或小黑點，這種情況是怎么引起的呢？該怎么避免呢？原因：

黑點，大概有細胞本身帶的，環境有的，還有人身上帶進細胞間的,還有就是血清和培養基

1、如果小黑點有增殖趨勢，那么就有可能是污染了，需要處理；

2、如果小黑點沒有增殖趨勢，且不影響細胞生長，也不影響實驗的話，則可能

 a、是“黑膠蟲”，黑膠蟲究竟是一種生物還是非生物，本身就存在爭議。有人認為是從血清中來的一種原蟲，也有人認為是細菌，或是真菌，也有人認為是血清中的蛋白的結晶。“黑膠蟲”可寄生于動物細胞，也可以生存于培養基中，依靠hEM15A人子宮內膜異位癥患者在位內膜間質細胞永生化細胞和培養基中的營養為生，并隨細胞傳代而傳代。“黑膠蟲”與細胞競爭性生長，開始時對細胞并沒有什么影響，但當黑膠蟲的數量多到一定程度的時候， 細胞生長就會受到影響直至死亡，嚴重影響了科研活動的開展和進行。以前（這個至少是10年以前），很多實驗室在養細胞時用國產血清，那時的血清可能質量不過關，有所謂的“黑膠蟲”，但是也沒有明確的鑒定。但是現在的血清，即使國產的，產品里這種現象就少見了。

 b、是細胞碎片，或血清里德沉淀析出，在做布朗運動。

 c、是核糖體，也可能是雜質ZYC3357    人腦神經膠質瘤細胞    U-373MG-EGFP（Ubc-EGFP慢病毒構建穩定株)    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3358    人腦星形膠質母細胞瘤    U-87MG-EGFP（Ubc-EGFP慢病毒構建穩定株)    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3359    人食管癌細胞    Eca-109-GFP-puro(pLVT7慢病毒構建穩定株)    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3360    人舌鱗癌細胞    CAL 27-EGFP-puro(pLVT7慢病毒構建穩定株)    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3361    人結腸癌細胞    SW620-EGFP-puro（慢病毒構建穩定株)    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3362    人原位胰腺腺癌細胞    BxPc-3-EGFP-puro （慢病毒構建穩定株)    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3363    倉鼠卵巢細胞亞株    CHO-K1-EGFP（CMV-EGFP慢病毒構建穩定株)    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3364    人肺癌細胞    PC9-EGFP-puro（慢病毒構建穩定株)    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3365        S8-EGFP-puro（慢病毒構建穩定株)    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3366    豬腎上皮細胞    PK15-EGFP-puro（慢病毒構建穩定株)    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3367    狗腎上皮細胞    MDCK-EGFP-puro（慢病毒構建穩定株)    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 
ZYC3368    猴胚胎腎上皮細胞    marc-145-EGFP-puro（慢病毒構建穩定株)    形態：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養條件：MEM/F12 +10% FBS 

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