當AML12小鼠肝細胞密度達到傳代密度且細胞活性在90%以上時，可以凍存細胞，在超凈臺中將要凍存的細胞移入離心管，1000rpm離心5min，棄上清，用90%培養(yǎng)液+10%DMSO的混合液重懸細胞，并調(diào)整細胞密度為4-6×106/ml，將細胞懸液分裝到凍存管中(1-1.5ml/管)。

含量：>1x10⁶ 個/mL，  規(guī)格：T75瓶或者1mL凍存管包裝

培養(yǎng)基：小鼠肝實質(zhì)細胞AML12完全培養(yǎng)液配方（100 mL）： 1:1混合的DMEM/F-12 (Invitrogen, 11330) 89 ml ITS Liquid Media Supplement (Sigma, I3146) 1 ml Dexamethasone 40 ng/ml FBS (Gibco) 10 ml

生長特性：貼壁生長

污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

運輸和保存：可選擇干冰運輸及發(fā)送復蘇存活細胞方式：（1）干冰運輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復蘇；（2）存活細胞，收到后應繼續(xù)生長，傳代達到細胞生長狀態(tài)良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養(yǎng)步驟。

AML12小鼠肝細胞傳代操作步驟：

一、貼壁細胞傳代

1.提前將培養(yǎng)基、PBS放入37℃水浴鍋內(nèi)預熱，用75%酒精擦拭后再放入超凈臺內(nèi)。

2.吸除或倒掉細胞瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，加少量PBS潤洗細胞。

3.加入適量胰酶，使胰酶的量能蓋住細胞，37℃孵育，每隔2~3min顯微鏡下觀察，待貼壁細胞間間隙變大、細胞趨于圓形但還未漂起時棄去胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基，晃動細胞瓶，終止胰酶作用。

4.AML12小鼠肝細胞用吸管小心吹打貼壁的細胞，制成細胞懸液。控制吹打的力度，避免產(chǎn)生大量的氣泡。

5.將細胞懸液分別接種到另外的2~3個細胞瓶內(nèi)，加入新鮮培養(yǎng)基，置37℃溫箱培養(yǎng)，隔天觀察貼壁生長情況。

二、懸浮細胞傳代

1.將細胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管內(nèi)，1000rpm離心5min。

2.棄去上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，用吸管小心吹散沉淀，制成細胞懸液。

3.將細胞懸液分別接種到另外的2~3個細胞瓶內(nèi)，加入新鮮培養(yǎng)基，置37℃溫箱培養(yǎng)。

AML12小鼠肝細胞 培養(yǎng)的過程中，經(jīng)常見到黑色的顆粒或小黑點，這種情況是怎么引起的呢？該怎么避免呢？原因：

黑點，大概有細胞本身帶的，環(huán)境有的，還有人身上帶進細胞間的,還有就是血清和培養(yǎng)基

1、如果小黑點有增殖趨勢，那么就有可能是污染了，需要處理；

2、如果小黑點沒有增殖趨勢，且不影響細胞生長，也不影響實驗的話，則可能

 a、是“黑膠蟲”，黑膠蟲究竟是一種生物還是非生物，本身就存在爭議。有人認為是從血清中來的一種原蟲，也有人認為是細菌，或是真菌，也有人認為是血清中的蛋白的結(jié)晶。“黑膠蟲”可寄生于動物細胞，也可以生存于培養(yǎng)基中，依靠AML12小鼠肝細胞和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)為生，并隨細胞傳代而傳代。“黑膠蟲”與細胞競爭性生長，開始時對細胞并沒有什么影響，但當黑膠蟲的數(shù)量多到一定程度的時候， 細胞生長就會受到影響直至死亡，嚴重影響了科研活動的開展和進行。以前（這個至少是10年以前），很多實驗室在養(yǎng)細胞時用國產(chǎn)血清，那時的血清可能質(zhì)量不過關(guān)，有所謂的“黑膠蟲”，但是也沒有明確的鑒定。但是現(xiàn)在的血清，即使國產(chǎn)的，產(chǎn)品里這種現(xiàn)象就少見了。

 b、是細胞碎片，或血清里德沉淀析出，在做布朗運動。

 c、是核糖體，也可能是雜質(zhì)PH-pc-r093    前脂肪細胞    Preadipocytes    形態(tài)：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養(yǎng)條件：MEM/F12 +10% FBS 
PH-pc-r094    成骨細胞    Osteoblasts    形態(tài)：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養(yǎng)條件：MEM/F12 +10% FBS 
PH-pc-r095    關(guān)節(jié)軟骨細胞    Articular chondrocytes    形態(tài)：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養(yǎng)條件：MEM/F12 +10% FBS 
PH-pc-r096    胎鼠真皮成纖維細胞    Fetal rat dermal fibroblasts    形態(tài)：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養(yǎng)條件：MEM/F12 +10% FBS 
PH-pc-r097    胎鼠表皮角質(zhì)形成層細胞    Fetal rat cell layer ofkeratinocytes    形態(tài)：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養(yǎng)條件：MEM/F12 +10% FBS 
PH-pc-r098    成年鼠表皮角質(zhì)形成層細胞    Adult rat cell layer ofkeratinocytes    形態(tài)：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養(yǎng)條件：MEM/F12 +10% FBS 
PH-pc-r099    表皮角質(zhì)形成細胞    Visceral fat cells    形態(tài)：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養(yǎng)條件：MEM/F12 +10% FBS 
PH-pc-r100    皮下脂肪細胞    Chondrocytes cells    形態(tài)：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養(yǎng)條件：MEM/F12 +10% FBS 
PH-pc-r101    內(nèi)臟脂肪細胞    Osteoblasts cell    形態(tài)：貼壁，懸浮均有；上皮細胞樣    培養(yǎng)條件：MEM/F12 +10% FBS 

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