細胞培養過程中的隱形污染（支原體）是普遍的問題，面對支原體污染帶來的巨大難題，世界各國開始重視，對細胞進行了質量控制，得到了有效控制。

支原體是什么？

支原體是目前已知一類能在無生命培養基上生長繁殖的最小的原核細胞微生物，無細胞壁，直徑為0.1-0.3μm，且形態易變，極易通過除菌過濾器。大部分支原體繁殖速度比細菌慢，細胞培養過程中遇到的支原體95%都來自于以下四種支原體：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾支原體，其中萊氏無膽甾支原體為牛源性。

采用常規的顯微鏡無法直接觀察到支原體，當細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染后，細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發生改變，而細胞的生長率一般并未發生顯著的影響，因而細胞被支原體污染一般難以察覺。因此細胞都需要定期（如每個月）進行支原體污染的檢測。

如何判斷細胞是否被支原體感染？

一般根據支原體種類不同，采取不同的方法進行檢測。目前常用的檢測方法有：培養法、 ELISA、直接或間接的熒光染色、PCR法等，其中，前面幾種靈敏度、培養周期等都較長，對于普通養細胞的人來說不太實用。目前 PCR法靈敏度最高。且耗時較短。操作簡單、可一次做多個細胞樣本。

PCR法是20世紀80年代中期建立起來的一種體外DNA 擴增實驗，其基本原理是酶促DNA合成反應，即在DNA模板、引物和脫氧核糖核酸存在下，經DNA聚合酶的作用，使DNA鏈擴增延伸。

支原體檢測試劑盒圖（貨號：ZQ505-K） 
 

1、Myco-PCR-Mix中加入了電泳測試時所需的色素試劑（藍色和黃色色素），PCR 反應完畢后可以直接進行凝膠電泳，反應液呈現鮮艷的綠色。這種預混液方案操作簡便，可最大限度地減少人為誤差，在較短時間內即可獲得檢測結果。

2、本產品克服了PCR 反應配置過程中的繁瑣程序，通過加入抑制非特異性結合的 cocktail，有效的整合了所有PCR反應成分，實現了一步法 PCR 技術新的突破。

3、引物

我司的引物序列通過參考文獻和查閱大量信息和驗證后發現相對市面上的引物，我司引物靈敏度更高。

通過對比不同品牌的支原體檢測試劑盒,結果發現陽性樣本在同一塊膠體上是有一定差異的。陽性樣本經過3、9、27倍數稀釋后試劑盒A仍然能夠明確的檢測出來，且弱陽性條帶也相對其他試劑盒更突出。

（以下是重復3上次檢測后提供的參考圖）

樣本1為陽性樣本3倍稀釋、樣本2為陽性9倍稀釋、樣本3為陽性27倍稀釋、樣本4為弱陽性、樣本5為弱陽性、樣本6為陽性對照、樣本4為陰性對照性。Maker為1500bp

實驗樣本：

用于檢測支原體的樣品是接種后進行 3-6 天細胞培養的培養上清液。如果使用常用的細胞培養基，培養上清可直接加入到 PCR 反應液中。如果使用細胞懸濁液作為樣品，則需要提取 DNA，再進行 PCR 反應。

實驗步驟

反應體系：    Myco-PCR-Mix           24ul

                     待檢測細胞上清液          1ul

按照以上反應比例，在PCR管中將待檢測樣品上清液 1ul加入到24 Myco-PCR-Mix中，每次檢測請用Positivecontrol模版作為陽性對照，用Negative control模版作為陰性對照。

PCR反應程序為：95℃ 5min，（95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 90s）30 個循環，72℃ 5min， 40℃ 保存。PCR產物跑1.5 % 瓊脂膠，用DL2000的DNA Marker顯示片段大小。

檢測結果

待檢測樣品中如果出現與陽性對照大小一致（450-600 bp）的條帶，說明樣品被支原體感染。
 

如果您的細胞不幸感染了支原體，最最最好的處理方式是立即丟棄該細胞，并對培養箱、超凈臺等設施及場所進行消毒滅菌。因為支原體的傳播非常隱秘，相關研究表明其甚至能通過氣溶膠傳播。當然，如果您的細胞非常珍貴或者不能再獲得，可以嘗試使用抑制支原體的藥物進行處理，嘗試消除支原體污染。

這個過程一般周期較長，因為使用藥物處理時需配合多次大比例連續傳代來提高成功率。堅持，就是勝利！

支原體清除試劑盒（貨號：CSP037）
 

1、本試劑含有兩種有效的針對支原體的抗生素，抑制或清除支原體的效果通常會更強一些，其作用機制是通過干擾核糖體轉運而抑制蛋白質的合成

1、推薦使用比例為 1:200，例如 5 mL 的完全培養基加入 25 μ  L 支原體抑制劑混勻；

2、棄去舊的培養基（貼壁細胞） ，用無菌的緩沖溶液將細胞清洗干凈， 再加入含有支原體抑制劑的新鮮培養基；

3、根據細胞增殖情況更換含有抑制劑的培養基或傳代； 一般加入抑制劑后3天左右， 會出現明顯 的效果， 連續使用兩周后建議用支原體檢測試劑盒進行檢測。若細胞污染非常嚴重時，需延長使用時間。

4、環境、試劑耗材等可能一直存在污染源，建議需定期進行支原體檢測。
 

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2、活動對象：僅限終端客戶參與活動
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