CRISPR-Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可對抗入侵的病毒及外源DNA，可以將入侵噬菌體和質粒DNA的片段整合到CRISPR序列中，通過相應的CRISPR RNAs（crRNAs）來指導Cas9蛋白對同源序列的降解，進而提供免疫性。根據CRISPR/Cas系統的特性，科學家將其改造成了目前最高效的基因組編輯工具。

2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier證明CRISPR/Cas9系統可以在體外切割雙鏈DNA；2013年，張鋒首次用CRISPR/Cas9系統在原核生物 (大腸桿菌) 中實現基因組編輯。目前應用最廣泛的CRISPR/Cas9系統是來源于化膿性鏈球菌的CRISPR/Cas9系統。

CRISPR-Cas9系統由三個原件構成：tracrRNA+crRNA嵌合成的sgRNA（single guide RNA）+宿主DNA序列上的PAM序列（protospacer adjacent motif）+Cas9剪刀（最常用的是化膿性鏈球菌來源的SpCas9蛋白）。sgRNA引導Cas9剪刀到與sgRNA的5’末端堿基互補的（長約20nt的）靶序列處，緊接這段互補序列下游若存在能被Cas9蛋白識別的PAM序列（SpCas9特異性識別的PAM是由3bp組成的NGG序列，N代表任意堿基），Cas9剪刀就會用兩個核酸酶結構域HNH和RuvC（在3～4nt upstream of PAM的位點）剪開DNA兩條鏈，最終形成雙鏈斷裂double-strandedbreak (DSB)。

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基因敲除（Knock-out）  簡稱KO

Cas9蛋白可以對靶基因組進行剪切，形成DNA的雙鏈斷裂。在通常情況下，細胞會采用高效的非同源末端連接方式對斷裂的DNA進行修復。但是，在修復過程中通常會發生堿基插入或缺失的錯配現象，造成移碼突變使靶標基因失去功能，從而實現基因敲除。為了提高CRISPR系統的特異性，可將Cas9的一個結構域進行突變，形成只能對DNA單鏈進行切割造成DNA缺口的Cas9核酸酶，想要形成雙鏈斷裂的效果可以設計兩條sgRNA序列，兩條sgRNA特異性的靶向結合DNA互補的兩條鏈的靶標序列，即可形成DNA斷裂，并在修復過程中通過移碼突變實現基因敲除。

基因敲入（Knock-in） 簡稱KI

當DNA雙鏈斷裂后，如果有DNA修復模板進入到細胞中，基因組斷裂部分會依據修復模板進行同源重組修復（HDR），從而實現基因敲入。HDR修復模式在細胞中發生率較低，通常小于10%。為了增加基因敲入的成功率，目前有很多科學家致力于提高HDR效率，將編輯的細胞同步至HDR最活躍的細胞分裂時期，促進修復方式以HDR進行；或者利用化學方法抑制基因進行NHEJ，提高HDR的效率。

多重編輯（Multiplex Editing）

將多個sgRNA質粒轉入到細胞中，可同時對多個基因進行編輯，具有基因組功能篩選作用。多重編輯的應用包括：使用雙Cas9 nickases提高基因敲除的準確率、大范圍的基因組缺失及同時編輯不同的基因。通常情況下，一個質粒上可以構建2～7個不同的sgRNA進行多重CRISPR基因編輯。

功能基因組篩選

目前CRISPR的基因組篩選功能應用于篩選對表型有調節作用的相關基因，如對化療藥物或者毒素產生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構建病毒篩選文庫對潛在基因進行大范圍篩選等。