2016年1月19日，國際著名醫學期刊《Annals of the Rheumatic Diseases》（影響因子10.377，風濕病領域排名第1）發表中南大學湘雅二醫院陸前進教授研究團隊對系統性紅斑狼瘡的研究成果。陸教授團隊經過3年的艱苦努力，研究開發出一種特異性高、敏感性強系統性紅斑狼瘡新型診斷標志物，在國際上首次將對該疾病的診斷提升到基因水平。

      伯豪生物華南區銷售技術團隊在研究過程中的通力合作也得到了陸教授團隊的認可，伯豪生物會更加努力協助更多老師取得更大的科研成果。

研究背景：

      系統性紅斑狼瘡，俗稱蝴蝶病，是一種以過量產生多種自身抗體和多器官受累為特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病。患者體內存在多種自身抗體，抗體與抗原結合形成免疫復合物沉淀在靶組織中，引起一系列炎性介質釋放，從而造成器官組織的損傷。

實驗設計路線：

差異甲基化位點篩選

實驗方法：Infinium Human Methylation 450 BeadChips (Illumina)
樣本類型：外周血DNA
樣本數量：3例活動期患者 vs 3例正常對照；
                    3例穩定期患者 vs 3例正常對照；

顯著差異CpG位點篩選：｜avg. Δβ｜>0.1，且 p value < 0.05；

活動期患者 vs 健康對照
顯著差異CpG數量：2099個基因中 3719 CpG位點

穩定期患者 vs 健康對照
顯著差異CpG數量：539個基因中 983 CpG位點

選擇IFI44L作為候選標志物的原因：
1. IFI44L的所有顯著差異CpG位點均位于轉錄起始位點上游1500bp范圍和5’-UTR區域內；
2. IFI44L_cg06872964檢測到的CpG位點在活動期患者和穩定期患者外周血DNA中甲基化水平都顯著低于健康對照。
3. 課題組之前研究結果也曾發現，在紅斑狼瘡患者的CD4+細胞和中性粒細胞中IFI44L基因啟動子都呈現低甲基化狀態。

IFI44L是一種干擾素刺激基因，也就是能被干擾素誘導上調表達的基因。早期研究發現其有一定的抗丙肝病毒活性，最近研究還發現病毒感染會引起人外周血單核細胞IFI44L基因表達上調。

接下來，研究人員開始針對IFI44L啟動子區特殊CpG位點，即芯片中cg06872964探針覆蓋的2個CpG位點甲基化水平進行了大樣本量的焦磷酸測序檢測，作為探究該CpG位點是否可作為系統性紅斑狼瘡診斷標志物的依據。

 

后期驗證：共有 4210 個患者和志愿者參與了后期的驗證工作。

探索組驗證 (驗證中國患者對候選標志物的特異性和敏感性)

實驗方法：焦磷酸測序 (Pyrosequencing)

樣本類型：外周血DNA

樣本數量：

377例紅斑狼瘡患者 vs 358例正常對照
353例類風濕性關節炎患者 vs 358例正常對照

實驗結果：
在紅斑狼瘡患者的外周血單核細胞DNA中，Site 1和Site 2這兩個CpG位點的甲基化水平明顯低于健康對照和類風濕性關節炎患者。

驗證組 1 （驗證中國患者對候選標志物的特異性和敏感性）
實驗方法：焦磷酸測序 (Pyrosequencing)
樣本類型：外周血DNA
樣本數量：
529例紅斑狼瘡患者 vs 569例正常對照
429例類風濕性關節炎患者 vs 569例正常對照
199例原發性干燥綜合癥 vs 569例正常對照

 

驗證組 2 （驗證歐洲患者對候選標志物的特異性和敏感性）
實驗方法：焦磷酸測序 (Pyrosequencing)
樣本類型：外周血DNA
樣本數量：615例紅斑狼瘡患者 vs 781例正常對照

IFI44L啟動子甲基化與臨床特征的關系
      將906例中國紅斑狼瘡患者，按照臨床特征分成290例腎損害和616例無腎損害兩組，結果發現伴有腎損害的患者IFI44L啟動子甲基化水平明顯低于無腎損害的患者。

另外，研究人員還分別對30例紅斑狼瘡患者的癥狀活動和緩解時期的血液樣本DNA中2個CpG位點的甲基化水平作了比較，其中86.67% (26/30)和66.67% (20/30) 的患者在緩解期的甲基化水平要高于活動期。

     研究進行到這里，雖然說就已經可以證明IFI44L啟動子甲基化水平是一種特異性高、敏感性強的系統性紅斑狼診斷標志物，但仍不清楚IFI44L甲基化水平變化的原因。

      因為系統性紅斑狼瘡患者最顯著的一個特征就是外周血單核細胞中受Ⅰ型干擾素調節的基因異常持續過量表達，即所謂“干擾素標記”現象。而且考慮到IFI44L本就是一種干擾素刺激基因，所以研究人員首先懷疑是否可能是由于紅斑狼瘡患者體內Ⅰ型干擾素過量表達才觸發紅斑狼瘡患者IFI44L啟動子的甲基化水平降低。

      為了弄清楚這個疑惑，研究人員采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法，分別從系統性紅斑狼瘡患者和健康對照的20ml外周血中分離得到外周血單核細胞。研究人員將單核細胞置于在RPMI-1640培養基中培養， 同時用1000 U/L 干擾素-α 刺激單核細胞。焦磷酸測序結果顯示在單核細胞培養過程中，即便研究人員使用干擾素-α對單核細胞刺激的時間達到48小時，但作為診斷標志物的IFI44L基因兩個CpG位點在患者和健康對照兩組的甲基化水平都沒有發生明顯變化，也就表明并不是由于系統性紅斑狼瘡患者體內干擾素-α升高才導致患者IFI44L基因的甲基化水平降低。

    本文中的450K甲基化芯片服務以及焦磷酸測序服務均由上海伯豪生物技術服務有限公司提供。

原文出處：
Zhao M, Zhou Y, Zhu B, Wan M, Jiang T, Tan Q, Liu Y, Jiang J, Luo S, Tan Y, Wu H, Renauer P, Del Mar Ayala Gutiérrez M, Castillo Palma MJ, Ortega Castro R, Fernández-Roldán C, Raya E, Faria R, Carvalho C, Alarcón-Riquelme ME, Xiang Z, Chen J, Li F, Ling G, Zhao H, Liao X, Lin Y, Sawalha AH, Lu Q. IFI44L promoter methylation as a blood biomarker for systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 19 January 2016 [PMID: 26787370 ]